Способ получения тимозина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ СОЮЗ СфввтСКНКСЦНаЕКтНЧЕЕКНКРеспублнн ц 975017(22) Заявлено 1703,81 (21) 3289181/28-13с присоединением заявки Мо -(311 М. Кп.з А 61 К 35/56 Государственйый комитет СССР йо делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 23.11.821 Заявитель Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОЗИНА Иэоб не, в ч гормон названи ный ти щего в тивност ми глаью. ли 10 30 ретение относится к медициастности к получению сходноального вещества под общимем "тимоэин" или гормональмусный Фактор (ГТФ), обладаюыраженной биологической акын со специфическими Функциявным образом в отношении иммунных явлений.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаеМОму эффекту является способ получения тимозина, предусматривающий гомогенизацию вилочковой желюзы, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку.Согласно известному способу свежий тимус крупного рогатого скота, взятый со льда, гомогенезируют в физрастворе, а затем центрифуги - руют, Надосадочную жидкость собирают и нагревают до 80 оС и после удаления осадка Фильтруют через мелкоячейные фильтры (0,45 р ), после обработки ацетоном, Фильтрования и повторного осаждения при помощи(ИН 4)504 при рН = 4,0, пропускают через хроматографическую колонку и получают чистый тимозин (5-я фракция) Г 13К недостаткам известного способа относится то, что он не позволяет получить максимальное количество целевого продукта, обладающего достаточной биологической активностЦелью изобретения является уве чение выхода целевого продукта и повышение его активности.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тимозина, предусматривающему гомогенизацию вилочковой железы, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматограФическую колонку, вилочковую железу каспийского тюленя 10-15 дневного возраста перед гомогениэацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводят полную дезинтеграцию оставшихся клеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществляют добавлением 10 мМ раствора фос 975017форнокислого натрия при рН7,0- 7,2 и соотношении 1:9-1;10, далее центрифугируют, полученный супернатант подкксляют 10-.ным раствором уксусной кислоты до рН4,0-4,2, затем обрабатывают 50-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, к образовавшемуся осадку добавляют 10 мМ трио-хлор буфер при рН щ 8,0-3,2, лиофилизируют и до пропускания через хроматографи ческую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мм трис-хлор буФер.Способ осуществляют следующим об,разом. 15Вилочковую железу (тимус) в замороженном состоянии (-49 С ) добавляют н лабораторию и размораживают при комнатной температуре, Затем следует максимальная очистка тимуса от соединительной ткани, гомогениэация с физраствором в соотношении 1:3, ультраторакс, дезинтеграция ,оставшихся клеток ультразвуков. После центрифугирования при 12000 д удаляют осадок, а супернатант (1-я Фракция)нагревают до 80 С с последующим центрифугированием (45000 д), Полученный супернатант является 2-й фракцией, которую затем при 4 С обрабатывают ацетоном (предварительно)охлажденным до -10 С в соотношении 1:5. Полученную смесь центрифугируют (15000 д), после чего полученный осадок (3-я фракция) растворяют 10 мМ раствором ИаР 04 (рН = 357,0) в соотношении 1:10, добавляют (ИН, ), 504 насыщенного раствора в количестве 25 к предыдущему объему. После кратковременного центриФугирования полученный супернатант 40 подкисляют 10-ным раствором СНСООН до рН4,0 и добавляют 50-ный раствор (ЙН 4) 504. Далее центрифугируют 15 мин, полученный осадок растворяют 10 мМ трис-С 1 буфером 45 (рН = 8,0) и лиофилизируют (4-я фракция), После этого сухое вещество растворяют в минимальном количестве 10 мМ трис-С 1 буфере и пропускают через хроматографическую колонку 5 ерЬадех с коллектором фракций для получения 5-й фракции ГФТ. Полученный материал лиофилизируют.П р и м е р, Каспийский тюлень РЬоса саар 1 са был добыт в марте 1980 г. на ледовых залежах Северного Каспия. Нз препарированных тушек были извлечены тимусы в количестве 1,0 кг и заморожены (-10 С). Через дне недели размороженные при комнатной температуре железы были очищены от соединительной и зпителиальной тканей пропущены через мясорубку и затем помещены на время (10-15 мин) в гомогеннзатор. В образовавшийся гомогелат добавляют 65 физраствор, (0,15 М раствор Иас 1) в соотношении 1:3 и продолжают обработку на ультратораксе в течение 10-12 мин, После этого весь материал центрифугируют 1 ч (12000 д) и после удаления осадка получают 1-ю фракцию.Надосадочную жидкость сливают в колбу с термостабильным стеклом и помещают в водяную баню, температуру в которой постепенно доводят до 80 С, затем вынимают колбу и охлаждают. Потом следует центрифугирование (45000 д) в течение одного часа, полученный супернатант является 2-й фракцией. Затем его помещают н холодильник (-4 С) на 1,5 ч после чего смешивают с охлажденным при -40 С ацетоном (ХЧ) в соотношении 1:5. Смесь центрифугируют (15000 д) при низкой температуре в течение одного часа. Полученный осадок является 3-й фракцией ГФТ.Осадок затем растворяют в 10 мМ растворе ИаРО (рН7,0) в соотношении 1 г 10, добавляют (ИН 4)50+ (насыщенного раствора) в количестве 25 к основному объему. После 15-ти минутного центрифугирования (3500 об/мин) полученный супернатант подкисляют 10-ным раствором СН 9 СООН до рН = 4,0 и добавляют 50-ный раствор (ЙН 4)а 504 . Далее центрифугируют смесь 20 мин (3500 об/мин), полученный осадок растноряют примерно в 500 мл (до полного растворения) 10 мМ трис-С буфера (рН = 8,0) и лиофилизируют (4-я фракция). После этого высушенный материал растворяют в 50 мл трис-С 1 буфера и пропускают через хроматографическую колонку 5 ерЬадех (6-50). Полученную таким образом Фракцию с молекулярным весом 12200 подвергают лиофилизации (5-я фракция), Вещестно представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде, Конечный ныход.вещества из 1 кг сырого веса примерно 250 мг лиофилизированной 5-й фракции ГФТ, а выход аналогичного тимозина, полученного из тимуса крупного рогатого скота по известному способу соотнетственно, 120 мг. Для сравнения биологической активности стандартного тимозина и ГФТ из морских млекопитающях были поставлены серии опытов на линейных мышах 7 СВА С 57 В 1/б), зараженных 5 а 1- вопе 11 а сур 61 вог 1 оа.Всего было заражего 90 мышей. Результаты опытов показывают, что действие ГФТ из морс ких млекопитающих по своей активности (,100-я защиты от инфекции ) выше аналогичного тимоэина из крупного рогатого скота почти в 2 раза,Заказ 8864/4 Тираж 714 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Биологическая активность стандартного тимоэина и тимоэина иэ тимусакрупного рогатого скота представленав таблице. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным. Позволяет увеличить выход целевого продукта в 2 раза.Тимоэин, получаемый предлагаемым способом, обладает более биологической активностью (действие тимозина, полученного предложенным способом, было виае почти в 2 раза, чем тимо- зина, полученного известным спосо- бом) ФОрмула изобретения Способ получения тимоэина путемгомогенизации вилочковой железы, центрифугирования, нагревания надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетономосаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси черезхроматографическую колонку, о т "л и ч а ю щ и й .с я тем, что, сцелью увеличения выхода целевогопродукта и повышения его активности, вилочковую железу каспийскоготюленя 10-15 дневного возраста перед гомогенизацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводятполную,дезинтеграцию оставшихсяклеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществлят добавлением 10 мМ раствора фосфорнокис лого натрия при рН = 7,0-7,2 и соотношении 1:9-1:10, далее центрифугируют, полученный супернатант подкисляют 10-ным раствором уксуснойкислоты до рН = 4,0-4,2, затем обрабатывают 50-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, кобразовавшемуся осадку добавляют10 мМ трис-хлор буфер при рН = 8,0"8,2, лиофилиэируют и до пропускания через хроматографическую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мМ трио-хлор буфер,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1601 дбйеп А. Ргос. Мас 1.Асад. 5 е 1. 05 А, 1972, 69, р. 1800.