Способ получения фибринолитическогофермента

;.;Л".:КТнп;-:. 1.- .:"О П И С А Н И Е (11) 434662ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(33) ФранцияОпубликовано 30.06.74. Бюллетень М 24 Государственный комитет Совета Министров СССР оо делам изооретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 23.12.7 72) Авторы изобретения Иностранцы ндрэ Беллос, Жан флоран, Жан Люн и Жан Веррьер(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТАИзобретение относится к ферментной про. мышлснности, в частности к получению фибринолитических ферментов.Известны способы получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости. Предлагаемый способ позволяет получитьболее активный фермент,Для этого в качестве продуцента используют штамм Ягер 1 огпусез чепе 1 цз Р 8 24288(МККК.) 3987,Способ получения фибринолитического фермента, названного Энзим 22750 КР, заключается в том, что микроорганизм Ягер 1 огпусез чепе 1 пз Р 5 24288 или его мутанты выращивают поверхностным или глубинным методом в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота,минеральные соли, стимуляторы роста, сгустители,Перед выращиванием только штамма впроизводственном ферментере готовят посевную культуру по следующей схеме: хранение - выращивание вначале на агаре, затемво встряхиваемой колбе и в ферментере дляполучения инокулума,В качестве ассимилируемых источниковуглерода могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины, амидон, меласса или другие насыщен ные углеводородами вещества, такие как сахарные спирты, например глицерин или манит, или некоторые органические кислоты: молочная, лимонная, винная. Некоторые животные или растительные масла, например 10 масло шпига или соевое, могут с успехом заменить углеводородные источники или служить добавками. В качестве источника азота могут быть использованы простые химические вещества, например нитраты, минеральные 15 соли или органические соли аммония, мочевины, аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие в основном азот в виде протеидов - казеин, лакталебумин, глутен и их гидролизаты, соевая мука, арахидовая му ка, рыбная мука, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, отходы пивоваренной промышленности, кукурузный экстракт.Среди дополнительных неорганических элементов некоторые могут иметь действие бу ферного раствора или нейтрализатора, например щелочные или щелочноземельные фосфаты или карбонаты кальция или магния.В среду могут быть введены вещества, которые вносят необходимое ионное равновесие в 30 развитие Ягер 1 отпусеэ чепе 1 ыз РЬ 24288 и на19проведения электрофоретического анализа около 37% активного фактора,200 мг, приготовленного в указанных выше условиях продукта, добавляют в 3 см фосфатного буферного раствора 0,01 М с рН 6,5, 3 смз изопропанола и 4 г целлюлозы в порошке для хроматографического анализа.Полученную таким образом пасту помещают ровным толстым слоем на верхушку целлюлозной колонки диаметром 3 см, содержащей 80 г целлюлозы в смеси объема к объему изопропанола и буферный фосфатный раствор 0,01 М с рН 6,5 (высота 39 см). Добавляют буферную смесь фосфат - изопропанол, увеличивая линейное содержание буферного раствора в смеси от 50 до 100% в объемах (общий объем элюента с градиентом композиции составляет 1,5 л); расход 35 смз/час. Элюат собирают фракциями примерно по 20 см и измеряют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора УВИКОРД Л,К.В. при 280 нм. Полученная диаграмма имеет первый очень асимметричный пик, затем на расстоянии второй симметричный пик, соответствующий концентрации буферного раствора 78 - 92%, Электрофоретический анализ показывает, что второй пик содержит активный фактор.Собирают фракции, соответствующие второму пику (фракции 53 - 70 С, около 415 смз), затем удаляют спирт выпариванием при давлении 2 мм рт. ст., затем проводят диализ через мембрану из регенерированной целлюлозы с противотоком 10 л дистиллированной воды в течение 24 час при 4 С и сушат лиофильно.Таким образом, получают 43 мг продукта с активностью 6200 УК/г и в соответствии с электрофоретическим анализом, содержащим примерно 55% активного фактора,П р и м е р 2. 3 г продукта активностью 1600 УК/г, полученного при условиях, описанных в примере 1, растворяют в 40 сма буферного барбиталового раствора с рН 8,6 мк 0,0375 и этот раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 48 час с противотоком 10 л того же буферного раствора при 4 С.Раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 12000 д и температуре 4 С, затем наносят на верх колонки для подготовительного электр офореза, содержащей 1,3 кг целлюлозы в барбиталовом буферном растворе с рН 8,6, мк 0,075 (что дает высоту 66 см).Затем подают напряжение 500 в (анод вверху); сила тока 0,46 а; температура внутри колонки 20 С. Эту температуру поддерживают циркуляцией в двойной стенке охлаждающей жидкости при 4 С. По истечении первого часа электрофореза окрашенные примеси переходят в анодный отсек. Окрашенный буферный раствор отделяют и заменяют свежим раство ром, Эту одердцли првторя 1 от несколько раз. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 20Удаление пигментов достигнуто почти полностью по истечении 6 час электрофореза. Затем напряжение снижают до 400 в (1 0,32 а) и в нижней части колонны проводят элюирование при расходе 250 см/час противотоком. Элюат собирают фракциями примерно по 50 см и определяют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. По истечении 15 час такого режима напряжение повышают до 500 в (1 0.40 а) и скорость алюирования противотоком 125 смз/час. Через 10 час после начала операции электрофорез прекращают. Затем в колонку сверху вливают барбиталовый буферный раствор из расчета 210 см/час.Полученная диаграмма представляет первый маленький пик (к 23 час электрофореза), затем три больших пика, находящихся на значительном расстоянии друг от друга. Электрофоретический анализ показывает, что только в третьем пике содержится активный фактор. Группируют фракции, соответствующие указанному третьему пику (около 1425 смз), концентрируют до 400 см выпапиванием при давлении 2 мм рт, ст., затем трижды диализуют в течение 24 час каждый раз с 50 л дистиллированной воды при температуре 4 С,Диализованный раствор концентрируют до 10 см выпариванием при давлении 2 мм рт. ст затем охлаждают до 4 С. В раствор при перемешивании медленно добавляют 100 смз изопропанола, охлажденного до - 60 С. Собирают активный осадок центрифугированием в течение 10 мин при 12000 д и при - 10 С, затем сушат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии РО, и температчпе 20 С,Таким образом, получают 276 кг продукта с активностью 7000 УК/г и содержащего в соответствии с электрофоретическим анализом около 65% активного фактора.Продукт содержит углерод, водород. кислород, азот, фосфор и серу, Его состав по элементам близок к следующему, %; С 44,0; Н 6.5; М 12.5; Р 0,35; 5 0.65.Кислый гидр олиз позволяет выявить следующие аминокислоты с содержанием на 10 г продукта, ммоль: аспарагиновая кислота 8,5, треонин 7, серии 6,5, глутаминовая кислота 5, пролин 2, глицин 10,5, алании 7.5. валин 5,5, изолейцин 2. лейцин 3, тирозин 3,5, фенилаланин 1, лизин 2, аргинин 2 и гистидин 1,5.Он обладает следующими физическими свойствами.Внешний вид -бежевая пудра (после лиофилизации) . УФ-спектроскопия (определение по 0.02%ному раствору в воде): абсорбция при 210 нм;1 см 205;минимальная абсорбция при 250 нм; Е 1",7,8;максимальная абсорбция при 278 нм;Е 1 мИК.спектроскопия (определение по таблетквм в смеси с 1 ВЧ),.434662 22а о 10 3-(-0 3а о = - 17,7+0,3. Лктивность продукта на различные вещест 5 ва приведена ниже: Активность (УК/г) ВеществоКазеиназо-КазеинЖелатин РеакцияПротеолиз 7,000 15000 1000Сгусток бычьего фибринаСгусток плазмы кролика Сгусток плазмы сабаки 2500 фибринолиз 4100200000 ВАЕЕ АТЕЕ 3000 500 Эстеролиз Пример 3. 22,8 г продукта, полученного при условиях по примеру 1 с активностью 2400 УК/г, добавляют в 480 смз дистиллированной воды; рН раствора равен 7,4, Последующие операции проводятся при температу ре +4 С.Раствор наносят сверху целлюлозной колонны диаметром 15 см, содержащей целлюлозу, импрегнированную дистиллированной водой на высоте 17 см. Оптическую плотность 15 элюата измеряют непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграмма представляет собой асимметричный пик, содержащий энзим, в то время как следы диамино,9-этокси-акридина, содержа щегося в продукте, остаются на целлюлозе.Элюат, соответствующий абсорбирующим фракциям, собирают (например, 6,9 л) и концентрируют при температуре, не превышающей 25 С, при давлении 2 мм рт, ст. до 25 480 смз475 смз предыдущего концентрата разбавляют 205 смз изопропанола, охлажденного до - 10 С, и полученный раствор наносят сверху колонны из целлюлозы, импрегнированной 30 смесью изопропанола и воды, содержащей 30 об./о спирта. Колонна диаметром 15 см содержит 600 г сухой целлюлозы (высота целлюлозы 7 см). Добавляют ту же смесь из расчета 450 см/час и измеряют непрерывно 35 оптическую плотность элюата на 280 нм, Элюат собирают фракциями по 20 смз. Полученная диаграмма представляет собой асимметрические пики. После прохождения второго пика (около 10 л элюата) пропорция во ды линейно возрастает до 100% в смеси (общий объем элюента с градиентом композиции примерно 22,5 л), затем разбавляют дистиллированной водой до получения фракций, поглощающих не более 280 нм (например, около 45 16 л), Последний абсорбирующий пик, разбавленный водой, находится между фракциями 950 и 1150.Эти фракции собирают (примерно1,6 л), концентрируют при давлении 2 мм рт, ст, до 50 Объема 150 смз, затем сушат лиофильно,21Ниже даются основные полосы ИК-абсорбции для продукта. Вращательная способность: определение пораствору концентрацией 0,5% в воде; Таким образом, получают 4,5 г продукта сактивностью 6400 УК/г и содержащего поэлектрофоретическому анализу около 60 О/оактивного фактора. 1,5 г продукта, полученного при вышеописанных условиях и с6400 УК/г, растворяют в 15 сиз раствора хлорида натрия 2 1 О - 4 М, охлажденного до +4 С.Раствор наносят сверху колонны биогеляР 60, диаметром 7,5 см, уравновешенной темже растворителем при +4 С и содержащейнабухший гель на высоте 122 см (что соответствует примерно 280 г сухого геля), Элюируют тем же растворителем из расчета120 смз/час. Элюат собирают фракциями примерно по 35 смз и измеряют его оптическуюплотность непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграммапредставляет собой симметричный пик с выступом в основнон части при начале элюирования, что доказывает наличие абсорбирующей примеси,Абсорбирующие фракции соединяют, удаляя примеси соответствующие элюированнойдо элюирования основного продукта, т. е.фракции 65 - 80 (например 580 см); концентрируют при давлении 2 мм рт. ст. до объема100 смз и лиофилизируют.Таким образом, получают 387 г продукта сактивностью 11 000 УК/г и содержащего поэлектрофоретическому анализу только белковый препарат (более 95% активного фактора),Предмет изобретения Способ получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из полу- ценной культуральной жидкости, отличающийй си тем, что, с целью повышения активности Фермента. в качестве продуцента использ) ют Чгер 1 отусез уепейз 05 24288 (МРК 1. 3987),И 0фиг. Изд,1828 Ти сударственного комитета Сове по делам изобретений и откр Москва, Ж, Раушская наб. раж 456 Подписнота Министров СССРытийд. 4/545 50 рН 2,2; мк 0,09рН 4,0; мк 0,1рН 8,6; мк 0,075р 1 96; мк 01 б 0 65 3копление фермента. Такими являются хлориды и сульфаты щелочных или щелочноземельных металлов. Некоторые являются активаторами метаболических реакций Ыгер 1 отусев чепецз РЬ 24288, например соли железа, кобальта.Что касается сгустителей, то обычно используются амидон, карбоксиметилцеллюлоза, агар.Вначале выращивания рН среды устанавливают 6,0 - 7,8, предпочтительно 6,4 - 7,5. Выращивание осуществляют при температуре 23 - 40 С (25 - 28 С является оптимальной) в течение 1 - 7 дней.Наиболее удовлетворительный процесс ферментации осуществляется при аэрации 0,3 - 2 л воздуха на 1 л/мин среды. Энзим 22750 КР может быть выделен из ферментационного сусла и очищен с применением обычных методов выделения и фракционирования белковых материалов, при этом активность и степень чистоты продукта контролируется соответствующими способами, например определением активности на казеине и электрофорезе,Энзим 22750 КР может быть выделен из фермента ционной среды фильтрованием последней в присутствии фильтрационной добавки, фильтрат концентрируют при приведенном давлении, подкисляют при рН, близком к 4, вновь фильтруют, диализуют потоком дистиллированной воды, затем осаждают фермент добавлением ацетона в диализат. Фермент энзим 22750 КР, полученный гаким образом, может быть затем очищен с использованием обычных физико-химических методов, В,частности, применяемые методы очистки, заключаются в растворении фермента в дистиллированной воде, с последующим осаждением при добавлении агентов, в водных концентрированных растворах которых фермент малорастворим, например в средних солях.Фермент может быть очищен хроматографией на различных основах, например алюминии, целлюлозе в порошке, гелях декстрина или полиакриламида, диализом или подготовительным электрофорезом.Фермент, полученный по данному способу, имеет следующую физико-химическую характеристику. Он очень легко растворяется в воде, в водно-спиртовых и водно-ацетоновых смесях, малорастворим в концентрированных растворах нейтральных солей (КаС 1; (МН 4)г 504) или полиэтиленгликоле и нерастворим в безводных спиртах, ацетоне, гексане, этилацетате, эфире и хлорированных растворителях,Фермент 22750 КР является протеином, вступающим в классические для протеина реакции (биуретовая реакция, реакция Фолина, окрашивание красным Понсо, черным амидам 12 ВИ или голубым Гомасси),5 10 15 20 25 30 35 40 Фермент содержит углерод, водород, кислО- род, азот и серу. Его элементарный состав следующий, %: С 50,4; Н 7,35; Х 17; 8 0,50.При проведении хроматографии на геле декстрана или геле полиакриламида молекулярный вес фермента равен 40000-+5000.Проведение кислого гидролиза фермента энзим 22750 КР позволяет выявить следующие аминокислоты, на 10 г продукта ммоль: аспарагиновая кислота 11,6, треонин 8,5, серии 7, глутаминовая кислота 3,5, пролин 2,5, глицин 13, алании 7, валин 4,5, метионин 1, изолейцин 2,5, лейцин 4, тирозин 5, фенилаланин 2, лизин 3, аргинин 2,5 и гистидин 2.Физические свойства фермента следующие.Внешний вид: белый порошок (после лиофилизации) УФ-спектроскопия (определение из раствора в воде 0,03%):абсорбция 210 нм; ",=187;минимальная абсорбция 250 нм; -,", =4,35; максимальная абсорбция 278 нм; Е",=13,35. ИК-спектроскопия (определение на таблетках в смеси с КВЧ).На фиг. 1 изображен спектр, на котором по оси абсцисс с одной стороны отложены длины волн, мк (высшая шкала), с другой стороны число волн, см -(низшая шкала), на оси ординат представлена оптическая плотность; на фиг. 2 дана диаграмма результатов, полученных с применением фермента энзем 22750 КР,Указанный спектр изображен на рис. 3, по абсциссе с одной стороны отложена длина волн, мк (верхняя шкала), с другой стороны число волн, см -(нижняя шкала), и на оси ординат представлена оптическая плотность,Основные полосы поглощения для данного продукта следующие.Вращательная способность: (определение на растворе 0,5%-ном в водс).го = - 14+05а 1 436 --- 29,2+0,6,3 а = - 53 5+О 8 фермент 22750 КР можно также отличить по его поведению при электрофорезе на геле ацетатцеллюлозы при использовании различных буферных растворов; лимонная кислота - вторичный фосфат натрия уксусная кислота - ацетат натриядиэтил - 5,5 - барбитуровая кислота (барбитал) едкий натр - глицинмк-ионная сила Индикация может быть осуществлена колориметрическими методами или измерением на протеолитическую активность,Например, при рН 4,0 активный фактор перемещается к катоду, происходит перемеще434662 Таблица 1 Активность знзимов Температура реакции,ЯС Концентрация субстратаСубстрат рН реакции Реакция Фермент 22750 КР ХимотрипсинСгусток бгячь его фибрина Сгусток плазмы кролика Сгусток плазмы собаки200000 10000 Субстрат 5 10-4 М Субстрат 5 104- М ВАЕЕ 25,0 7,7 Эстеролиз 17 34000 АТЕЕ 25,0 7,0 116000 йие 5 мм/2 час, при постоянном напряжении, равном 250 в (интенсивность изменяется от б до 15 ма),Фермент оказывает влияние на большое число субстратов, носящих белковый характер и, в частности на казеин, гемоглобин, фибрин. Очень незначительное воздействие оказывает на этиловый эфир бензоиларжинина (ВАЕЕ) и абсолютно не влияет на этиловый эфир ацетилтирозина (АТЕЕ).Воздействие на казеин определяется в соответствии с методом Кунитца, применяемой при дозировке трипсина.Растворимые в трихлоруксусной кислоте пептиды, освобожденные во время гидролиза,Тром болитическая и фибр инолитическая активность подтверждена испытаниями на лабораторных животных.При дозе 0,5 мг/кг, введенной внутривенно, фермент 22750 КР весьма значительным образом предохраняет кролика против внутри- сосудистой коагуляции, возникающей при проходе по шейной вене нейлоновой нити, импрегнированной коллагеном, Ускорение фибринолиза может быть выявлено у кролика при дозе 0,05 мг/кг, введенной внутривенно.Токсичность фермента 22750 КР изучена на многих видах животных. У мыши летальная доза определена при введении внутривенно 50% (ДЛ 50): она составляет 5 мг/кг; доза одна и та же при повторяющемся введении в течение 5 дней и при одноразовом введении. У кролика ДЛ 5 О, введенная внутривенно, составляет 1,5 мг/кг. 5 10 15 20 25 30 измеряются спектрофотометрией (измерение оптической плотности при 280 нм). Энзиматическая активность может быть выражена в единицах Кунитца (У, К), В соответствии с определением Кунитца, одна единица составляет количество энзима, который освобождает достаточное количество растворимых пептидов для того, чтобы оптическая плотность при 280 нм трихлоруксусного фильтрата возрастала до 1,000 в минуту.В табл, 1 представлены результаты, полученные с применением фермента 22750 КР в сравнении с двумя протеолитическими кристаллизованными энзимами; трипсином и химотрипсином. Благодаря таким свойствам фермент, полученный предлагаемым способом, можно применять в терапии для профилактики и лечения венозных тромбов, легочной закупорки сосудов, тромбозов венечных артерий, артерий конечностей и мозговых артерий.Микроорганизм - продуцент фермента 22750 КР - принадлежит к Ягер 1 отпусез чепе 1 цз РЬ 24288 (ИКК 1. 3987).Продуцент выделен из образца почвы, привезенной из Индии.Выделяют Ягер 1 оптусез чепе 1 цз Р 5 24288 по известной методике. Согласно последней в стерильную дистиллированную воду вводят небольшое количество почвы. Из полученной суспензии готовят пробы различной концентрации, Затем небольшой объем из каждой пробы наносят на поверхность питательной среды с агаром, находящейся в чашке Петри.Осуществляют выращивание колоний на поверхности среды в течение нескольких дней при температуре 25 С. Затем некоторые колонии изолируют и пересаживают на питательный агар - агар, находящийся в наклонном положении, для получения более обильных культур.Ягер 1 огпусез чепе 1 цз Р 8 24288 образует овальные споры размером 0,4 - б мк (чаще 1 - 1,2 мк), Спорофоры содержат спиральные нити, которые наматываются в 5 - 8 оборотов, но иногда превосходят это число. Часто встречаются спорофоры, располагающиеся на нитях, которые их держат, встречаются также спорофоры гроздями из нескольких элементов. По своей манере споруляции это начальное звено можно отнести к классу Бр 1 га классификации Придхама.Ягер 1 отусез чепе 1 цз Р 5 24288 хорошо развивается при температуре 25 С и 37 С, плохо при температуре 50 С. Он обладает способностью производить черный меланиновый пигмент в среде, подходящей для тирозина. Штамм образует НЬ. Нитраты восстанавливают в нитриты.Гидролизует амидон. Желатин сжижает. Молоко пептонизирует без предварительной коагуляции, Использует целлюлозу.Окрашивание мицелиума происходит поэтапно, в зависимости от среды, в которой он находится: от желтого к желто-коричневому, коричнево-желтого или темно-коричневого,Растворимые пигменты, которые он производит, имеют обычно коричнево-желтый тон, более или менее темный, в зависимости от среды, в некоторых случаях цвет может быть коричнево-черным, При наступлении споруляции его воздушный мицелиум окрашивается в голубой цвет. Культуральные и биохимические свойстваЯгер 1 отусез чепе 1 цз Р 5 24288 собраны в табл. 2. Представлены культуры, имеющие удовлетворительную стадию развития, т. е.выращенные в течение трех недель при 25 С.Качества продукта подвергнуты исследованию на питательных агарах и бульонах, которые обычно применяются для определения морфологической характеристики рода Ягер 1 огпусез, Выращивание на твердых средах проводилось на агарах в наклонном состоянии. Некоторые среды приготовлены по формулам, указанным в Тйе Ас 11 погпусе 1 ез, А, О. Ваксман, стр.193 - 197, Сйгоп 1 са Яо 1 ап 1 са Согпрапу, Ча 1- 1 йагп, Мазз; США, 1950. В этом случае эти среды обозначены в табл, 2 буквой В с номером, который был ей присвоен в Тйе Ас(1 погпусе 1 ез.Ягер 1 отпусез чепе 1 цз Р 5 24288 обладает признаками, которые точно не совпадают ни с одной характеристикой культур, ранее описанных и использованных в качестве основы.Фермент 24288 занимает место в известной серии ч 1 гЫосйгогподепез, при этом принимаются во внимание его свойства производить меланиновый пигмент, обнаруживать воздушный спорулированный мицелий голубого цвета, растительный мицелий от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, образовывать растворимые пигменты от желто-коричневого цвета до коричнево-желтого или очень темного коричневого, в зависимости от среды (органической или синтетической), и представлять собой спиральные спорофоры. Он не ;О может быть приравнен ни к одному из трехвидов, на которые ссылается Л. О, Ваксман, и составляющие эту серию, а именно: Ягер 1 огпусев ч 1 гЫосйгогподепез, Ягер 1 огпусез с 1 таг 1- гепз 1 з и Ягер 1 огпусез суапепэ. С одной стороны, он не может быть отождествлен с Ягер 1 огпусез суапепз, который образует на агаровых средах растительный мицелий, окрашенный в голубой цвет, этого никогда не происходит с ним; кроме того, в противовес Ь. чепе 1 цз РЬ 24288, 8. суапепз не использует целлюлозы и не восстанавливает нитраты в нитриты,С другой стороны, он не может быть отождествлен с 5, сйаг 1 гепз 1 з, который дает растворимый пигмент зеленовато-желтого цвета к черному на келатине и не дает растворимого пигмента на питательном агаре и картофеле, в то время как Ь. чепс(цэ Р 8 24288 дает растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на желатине, а также на питательном агаре и черный растворимый пигмент на картофеле.Наконец, он существенно отличается от8. ч 1 гЫосйгоподепез тем, что последний образует на некоторых средах растительный мицелий, имеющий оттенок очень темно-зеленоЗ 5 го цвета, иногда даже зелено-черноватого(в частности, на нитрированном синтетическом агаре с сахарозой, на желатине и на питательном агаре). 5. чепе 1 цз Р 24288 образует растительный мицелий, который во всех случаях 40 имеет цвет от желто-коричневого до коричнево-желтого и не имеет никогда зеленого оттенка, он также никогда не производит растворимого пигмента темно-зеленого цвета.5. ч 1 гЫос 1 тгогподепез не восстанавливает нит раты в нитриты, в то время как Ь, чепе 1 цзР 8 24288 восстанавливает их быстро и активно, как в синтетических, так и в органических средах.А, О, Ваксман относит также к группе 50 ч 1 гЫосйгогподепез некоторое число основных культур, описываемых Гозом и др. (Ецг К 1 аззйаегцпо бег Ас 11 погпусе 1 ез, б. Г 1 зс 1 тег, Вена, 1958); сравнивая его с последними, которые составляют основную часть серии бос гц 1 езсепз, Гоза, Ь. чепе 1 цз РЯ 24288 находился бы в последней группе, которая включает все основные культуры, среди которых растительный мицелий на агаре с амидонминеральным азотом Гоза имеет темный цвет и вклю чает только два вида: АсБпогпусез (Ягер 1 огпусез) ч 1 гЫосйгоптодепез и Ас(1 потпусез (Ягер 1 отпусез) соегц 1 ео 1 цзсцз, 5. чепецз Р 5 24288 отличается от вида 8, ч 1 гЫос)тгогподепез тем, что мицелий последнего на некото рых средах имеет темно-зеленую окраску.чх 2 М о с о хы о О Х И д О О х хх й о ох Д ох с ц Охх О о ОО х о х х х Ю о,ох ООдС 2й рЩй оОаОЕмОо й О х с од Е"о ХО 5 х ао а д о ох, х иУо Ох а 2 О йО М о й О х Р с о х й с ос й О х х, ах о д , йОК х Ье х о о Мх2О М о й О х ь с ох ох дх а О о й ., хха Рх д х а О,Фо ххы оОЙ ооО й о О Е" ы о О Ю оо О х Оэ х я ы,ц Ех х о о а О й й х д ы а Р 1 М х д О йаФ ц ххх Иййсой йьхядБмххо. н х д л Ц Х О одх хйо х а.Г о с, х у,ооЗИя цас оОйоО Х Яаахйоых х о сох З Я ад хи В ыц Зхх ООИ ы о о О аале х О О ХХХФ М й с ьо ц аех хх ай ой х М Ох оО д д д лйы О О х1 о а О 1 йо йО ко ой о о- й йоййфф ооЭЯ йо л й к о,ф Зоойоно0 ййЮ й й х 2 Л йх хах о о к й оок Охай й кох о Ю Охйа ай хо З оОхохохйфйфаохКйоО й 0Юцо йкк о о х й а ф, й СЧ йф о 33 а ой хЯ 3й к2 ф 1одфО .,2 ОфФ ййфэао хкйоОЫ ойК О охадОэх ОЧ 3 Ч 3 3303 к а 30 3 3 С 3 О) 3-3 Я3, 03 З 3й 3о0.Хо х2 УЭОйщайо-йха.оо аОи оОКХйЭ эф щ 223- 2 - ххоййдодфййкййо, йфаао" б,й"ХО Ойооих хс, к 3 х й х- о : щ й ой фй фх к ф У О й 2 "ф ао аай к "3 О) со О ой ы о со дОООао" о дах Ох оО Х с- УЫй со хы- О,О )ООХХ фОХОсс)ЫОХфсбфхОдуоа ыдо а ф со хС. х х ф хфООООх аМмСЧ хОсооох 2а=сооо)МОф30ОО,х о с) с)о С о)ходхсбфхоОсо ооО сх х д фЛ со ф фа О О О Щ фо фУсоф сох хы ох оЯОу О" ооафО С.)о,. досо с)о) у О О с- о х х аоОО У хо х ы О О ы х ъ о хо ф О) О о а хо хы ОО У Е Оо 2Оы оО Хй 5 дО Охх хф Уф оо ыдо) охоо соО О о))- оадХ Охх охО охо"С ОРо)х хх 434662О Ох фХ Ох хО,хо хооох)ыуофООБУоО".о с)мфОУфОИОУо)ос)хфО О2 фоООхоффх хО ХаО хЯфОофО О СОоаух сфОЫс)УООх иОа с) ссх"о)х )У ,ЗхО СО ОахОф хххф ф434662 Источники углерода Использование Источники азота Использование 0 в рибоО - ксилоза Положительное МО,ЫаМОгИа(1 ч Н,),НР О,АденинАденозинМоче вина Положительное 1. - а рабиноза1. - рамноза0 - глюкоза 0 - галактоза 0 в фрукто Рк-маниоза 1. - сарбозаЛактоза 1, - аспаргин Гликоколль Отрицательное Положител ь ное СаркозинРЕ - алании Отрицательное Положительное Мальтоза Сахароза Трегалоза РЕ - валин Положительное Положительное 01. - аспарагиновая кислотаРафиноза Декстрин Инулин Амидон ГликогенОтрицательное Положительное Отрицательное Положительное ГлицеринЭритриолАдонитолДульцитР - маннитР - сорбитолИнозитол 3ОтрицательноеПоложительное Отрицательное Положительное Отрицательное Положительное Салицин Положительное,но медленное 15Кроме того, в описании, приводимом Гозом и др., следует отметить, что Я. чгЫосЬгогподепез производит также растительный мицелий, принимающий темно-зеленый оттенок на молоке, на агаре с амидоном, на картофеле, на агаре с амидонминеральным азотом Гоза и не производит в последней среде растворимого пигмента. По сравнению с ним 5. епецз Р 5 24288 не дает никакого растительного мицелия темно-зеленого цвета в указанных средах и производит растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на агаре с амидонминеральным азотом Гоза. Образование растворимого пигмента темно-зеленого цвета на желатине, которое приводится Гозом для 8. 1 гЫосЬгоп 1 одепез, отсутствует для Я, епецз РЯ 24288.5. чепе 1 цз Р 5 24288 не может быть отождествлен с Я, сосгц 1 ео 1 цзсцз, который в противоположность ему не восстанавливает нитраты и не использует целлюлозу. Кроме того, Я, сосП р и м е р 1, Получение фермента. 200 сма культуры Ягер 1 опусез чепе 1 цз РЯ24288 высевают в колбу Эрленмейера и осу.ществдя 1 от кудьтивировацию при температуре 16гцео 1 цзсцз не дает растворимого пигмента в агаровой органической среде и на картофеле, в то время как Я, 1 епе 1 цз РЯ 24288 регулярно дает на всех испытываемых 5 средах органического происхождения растворимый пигмент коричнево-желтого цвета, а на картофеле дает растворимый пигмент черного цвета.Способность Я. епе 1 цз Р 8 24288 использо вать различные источники углерода и азотадля обеспечения своего развития определена в соответствии с принципом метода Придхама и Готтлиба (Ю о 1 Вас 1, 56, 107 в 1, 1948).Степень развития наблюдалась на основной 15 среде, указываемой в предлагаемом изобретении, с заменой глюкозы различными источниками углерода, либо 1 КН 4) ЬО различными источниками азота,20 Результаты приводятся ниже. 1. - аргинин 3Е - лизинР 1. - серии01. - треони нТаурин01. - фенилаланин1. - тирозинШ - пролин1. - гидроксипролинЕ - гистидин1. - триптофан5 етаин 26 С, неремсшивании и аэрации в течение 28 час.Выращенную культуру перссевают в ферментер емкостью 170 л, содержащей стериль.17 ную охлажденную среду следующего состава, г:ПептонМясной экстрактГидратированцая ггпокозаСоевое маслоХлористый натрийВода дополнение до 1 О л 6006001200120 смз600с рН 70. Перед стерилизацией рН среды устанавливают 7,5 добавлением 120 смз 10 н. каустической соды. Стерилизацию среды осуществляют барботированием пара при 122 С в течение 40 мин.40 л культуры полученной предыдущим выращиванием, вносят в ферментер емкостью 800 л, содержащей среду следующего состава, кг:Кукурузный экстракт (50%сухого экстракта) 8Соевое масло б л Сульфат аммония 0,8 Гексагидратированныйхлорид кобальта 0,008Вода дополнение ло 360 л Перед введением культуры в указанную среду рН среды устанавливают ца значении, равным 6,4 добавлением 450 смз 1 О и. каустической соды, после чего вносят карбонат кальция в количестве 2 кг и стерилизуют бароатированием пара при температуре 122 С в течение 40 мин и охлаждают. После охлажления объем среды составляет 390 л. Объем среды доводят до 400 л добавлением 10 л водного стерильного раствора, содержащего 4 кг гидратированной глюкозы; рН среды становится 6,6.Выращивание осуществляют при температуре 26 С, перемешивании центрифугой, аэрации стерильным воздухом в объеме 35 мз/час в течение 116 час. В процессе выращивания рН среды устанавливается 6,8.Протеолитическая активность культуральной среды составляет 0,4 УК/смз.Выделение фермента из среды. В 360 л среды ввели фильтрационную добавку, перемешивают и профильтровывают на фильтрпрессе. Полученный осадок промывают 100 л воды. В результате получают 400 л фильтрата с активностью фермента 0,35 УК/см.Фильтрат концентрируют при 3 С и получают 30 л концентрата с активностью фермента 3,77 УК/см;рН концентрата устанавливают 4,0 лобавлением 450 смз 6 н. соляной кислоты и затем вводят 300 г фильтрующей добавки. Отфильтровывают, полученный осадок промывают 2 л воды.Осветленный концентрат охлаждают до 4 С, продиализовывают через мембран из регенерированной целлюлозы в течение 7 чаг с протцвотоком дистиллированной воды при той же температуре. В приготовленный таким 1 збразам растВор медленно добавляют при 18перемешивании 9,6 кг кристаллического сульфата аммония (количество, вычисленное дляполучения раствора с 30% -ным насыщениемсоли), перемешивают в течение 20 мцн, затем отделяют осадок центрцфугированием, а в фугат прц перемешцвацци добавляют 5 кг кристаллического сульфата аммония (количество, вычисленное лля получения 52% насыщения), перемешивают в течение 15 мин, полученньш раствор выдерживают 15 мцн и цецтрифугируют.Собирают полученные осадки, добавляют1 л дистиллированной воды ц раствор подвергают диализу через мембрану цз регенерированной целлюлозы в течение 24 час при 4 С в противотоке с 40 л дистиллированной воды.Дцализат лцофильно сушат. Получают О гфермента активностью 1200 УК/г. После анализа на электрофорезе установлено, что он содержит около 13% активного фактора.Очистка фермента. Полученный вышеуказанным методом фермент растворяют в 4100 см дистиллированной воды, рН раствора устанавливают 8,0 введением 66 см каустической соды.В полученный таким образом раствор медленно вводят прц перемешивании 1,25 кг полиэтиленгликоля 1500, перемешивают еще в течение 15 мин. Раствор оставляют на 15 мин, затем центрифугируют при температуре 4 С.Активный осадок вводят в 700 ем дистиллированной воды и полученный раствор (800 смз) охлаждают до 4 С. При перемешиванцц в раствор вводят 4 л цзопропанола, охлажденного до - 60 С. Собирают актцвньш осадок центрифугированием, затем сушат при приведенном давлении (0,2 мм рт. ст.) в присутствии РО; при температуре, близкой к 20 оС40 Таким образом, получают 30,7 г продуктас активностью 1600 УК/г, содержащего после проведения анализа на электрофорезе около 20% активного фактора.10 г продукта, пол ченного при таких же ус ловиях, вводят в 400 см дистиллированнойводы. и рН раствора устанавливают 8,0 добавлением 3 смз каустическоц соды. В раствор медленно лобавляют при перемепивании 26,6 см водного 6%-ного раствора лактата лиамино-б.9-этокси-акридцна. После чополнительного перемешивания в течение 15 мин и 1 час отстоя центрифмгируют в течение 10 мин цри 12 000 д и температуре 4 С.Неактивньш осадок, полученный таким образом, улаляют, а фугат концентрируют при давлении 0.2 мм рт, ст. и температуре 25 С до объема 25 см, Затем раствор охлаждают ло 4 С при перемешивании и добавляют 250 см цзоиропанола, охлажденного до- 60 С. Пол ченный активный осадок собирают пентрифугированием в течение 15 мин при 12 ООО д и температуре - 10 С, затем сушат пои давлении 0,2 мм рт. ст, в присутствии РО; и 20 С. Получают 4,7 г продуктас активностью 2240 УК/г, содержащего после