Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы

. Сенженк тина ециальное конструкторско-технологическое бюр биологически активных веществ обпасти биопособам полурментов, а иммобилиэоля активацЫМ ИСПОДЬЗОянине,Ьо ттют сеэсеоъбиОхимии длядот (ДНК ия олиго-. илъзова ние этов медицине для,ои ран ния иммобипиром нуклеазы ко- роксилсодержаванными предном. В качестве няется агарозаическая сто воде агароенения фергических,про того циана кос зы огранич ментногоцессах, а Изобретение относится ктехнологии в частности к "чения иммобиднзованных феименно к способу полученияванной эндонуклеазы чеггои может использоваться вгидролиза нуклеиновых кисРНК) в процессах получени5 -мононуклеотидов. Испого препарата перспективнолечения гнойных абсцессовИзвестен способ подачезованных нуклеаэ, в котовалентно связывают с гидщими носителями, активироваритедьно бромистым цианосителя .чаще всего приме Низкая механическая, тети и сильное набухание в ивают обдасгь пр препарата в технол применение броми ии агарозы делает недопустивание этих препаратов в меНаиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения иммобилизованной нуклеазы 5 едтоФк юодсвас.еда . Фермент ковалентно связывают с органическимгидроксилсодержащим полимером м -аминобензипоксиметилдекстраном нри помощи реакции диазосочетания, Активированный носитель получают из коммерческого препарата декстра,иа - подигдюкина с мод. весом 6 ОООО.Способ иммобилизации фермента включает обработку полигдюкина хлористым 4 ь -нитробензилоксиметилпиридиниеьц выделение из полученной смеси Ф -нитробензипоксиметилподиглюкина; восстановление последнего до Ф-аминобензилоксиметилполигдюкина, диадиз, переосаждение и высушивание последнего; дназотирование 4 к -аминобензилоксиметидполнглюкина; связывание ферменте с диаэотированным М- аминобензилоксиметилподигдюкином; отде3 7388леиие иммобилизоввнной нуклеазы от непрореа 1 ировавшего полиглюкина при помощи гель-фильтрации.Полученный ферментный препарат рвстОворим в воде, при хранении при 12-15 Си рН 7,0 В течение двух месяцев сохраняет свою активность 2).Однако, получение препвративиах количеств иммобилизомнной эндонуклевзы известным способом требует специальных10методоВ Очистки, таких как гель-фильтрация и диализ. Способ трудоемок из-замногоствдийности. Применение иммобилеЭОВвнной эндонуклевзы В медицинских целях предполагает использование высокоочишенного исходного фермента. Но дажев этом случае возможность ее использования сомнительнатвк квк нет сведенийоб внтигенных свойствах иммобилизованной нуклеазы.хоПри создании непрерывных технологических процессов получения олигорибо-,олигодезокси-рибо-нуклеотидов и 5-моФнонуклеОтидОВ с использованием растворимых ферментных препаратов возникаетсложная задача Отделения их от продуктов реакции.Кроме того, данный способ иммобилизации эндонуклеазы ьеоба мс севсеоьне п редставляет возможность регулировать ЙНК-азную и РНК-взную активностиферментного препарата, т.е, влиять на специфичность эндонуклеазы к одному из субстратовБель изобретения - упрощение процесса иммобилизации, расширение. областиприменения иммобилиэованной эндонуклеаэы и увеличение специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов.Указанная цель достигается за счеттбго, что процесс получения иммобилизоВанной эндонуклеазы проводят в присутст вии субстрата (РНК или ДНК) в качестве полимера используют аминоэтилцеллюлоэу, предмрительно вктивированную глутвровым вльдегндом, причем Обычно количество используемого субстражв составляет 0,2-0,4 веса%а Процесс ОСУществляется следуияцим образом.яПроводят активирование АЭ-целлюлозыВодным раствором глутаровоГо альдегида.Затем производят связывание фермента С 6 КТИВИРОВВННОЙ МааТРИЦЕЙ В ПРИСУТСТВИИсубстратов (ДНК или РНК) в концентра:ции не менее 2 мгУмл. Полученный препарат обрабатывают раствором ИоЬН .Стабилизированный таким Образом иммобили":44зоввнный препарат промывают солевым раствором.Полученные препараты иммобилизоввнной эндонуклеазы обладают высокой удельной активностью, около 14000 ед,/г матрицы. Препарат сохраняет 60% активности в течение года при хранении 5-10 С ио рН 7,0. При гидролиэе РНК в проточной колонке в течение 15 дней ферментный препарат полностью сохраняет свою первоначальную активность в при гицролиэе ДЯК в реакторе с перемешиввнием эа это же время активность препарата падает незначительно, на 10%.П р и м е р 1. К 50 г влажной АЭ-целлюлозы добавляют 150 мл 25%-ного глутарового вльдегида и 250 мл дистиллированной воды. Смесь перемешимют лри комнатной температуре в течение 2-х ч. Затем актнвироввнную АЭ-целлюлозу промывают 0,2 М раствором ИаС 9,. К 50 г влажной вктивированной АЭ-целлюлозы добавляют 110 мл водного раствора . эндонуклеазы, содержащего 1740000 ед,акт, (зв единицу эндонуклевзной активности принимают количество фермента, вызывающее увеличение поглощения кислоторастворимых продуктов при 260 нм на 1 о,е. за 20 мин при 37 ОС; стандартное определение эндонуклеазной активности проводят по РНК) и 0,22 г ДНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной тем- пературе в течение 5 ч. Полученный препарат иммобилизоввнной эндонуклевзы отжимают на стеклянном фильтре и суспендируют В 500 мл 0,1%-ного раствора боогндрндв натрия в 0,1 и йа-фосфатном буфере (рН 8,0) в течение ЗО мин при 6 С, Стабилизированный таким образом иммобилизованный фермент промымют 1 М раствором ИаИ. Препарат иммо.бнлизовв нной андонуклевзы гидролизует как ДНК,твк и РНК, Удельная активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: РНК- азы 7980; ДИК-азы 14140, Активность ПНК-вэы в 1,8 раз превьнпает активность РНК-взы. Выход по активности составляет 20%. П р и м е р 2. К 5 г влажной АЭ- целлклозы добавляют 15 мл 25%-ного глутврового альдегида и 25 мл дистилли- . рованной воды; эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2-х ч, Затем вктивированную АЭ-.целлюлозу промымют 0,2 М раствором Май.К 5 г влажной вктивированной АЭ-целлюлО- зы добавляют 24 мл водного раствора эндоиуклеазы, содержащего 580000 ед.5 7355 акт, и 0,096 г т-РНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Полученный препарат иммобилизованной андонуклеазы отжимают на стеклянном фильтре и суспендируют в 50 мл 0,1%-ного раствора боргидрида натрия в 0,1 М йс-фосфатном буфере рН 8,0 в течение 30 мин при 6 С, Ста-лиэированный таким образом иммобилизомнный фермент промывают 1 М раст вором ЙоСЮ, Препарат нммобилизованной андонуклеазы гидролиэует как ДНК, так и РНК. Удельная активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: РНК-азы 14063; ДНК-азы 7050. Активность РНК-азы в 15 2 раза превышает активность ДНК-азы. Выход по активности составляет 10%,Как видно из примеров, связывание андонуклеаэы в присутствии одного из суб 26 стратов приводит к избирательному новышению удельной активности по одному иэ субстратов в 1,5-2 раза. Это позволяет применять иммобилизованную андонуклеазу для преимущественного гидролиза одного из субстратов (ДНК и РНК, если они оба содержатся в реакционной смеси.К преимуществам водонерастворимой иммобилизованной андонуклеазы относятся высокая стабильность, простота отде 30 пения нерастворимого ферментного препарата от продуктов реакции, возможность многократного использования в периодических технологических процессах и длительного использования в непрерывных. 35 процессах для получения олигорибо-, олигодеэокси-рябо-нуклеотидов и 5 -мононуклеотидов. Кроме того, способ не требует высокоочищенного исходного фермен 4 6та, а нерастворимые производные нукле-аэ перспективны как фармацевтическиепрепараты для местного лечения гнойныхран.формула изобретения1. Способ получения иммобилизованнойандонуклеазы 1 ь гоМо еюсе еаеп путем ковалентного связывания с органическим гидроксилсодержащим полимером о тл и ч, а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения пррцесса иммобилизации, расширения области применения иммобилизованной андонуклеазы и увеличения специфичности андонуклеазы к одному иэ субстратов (РНК или ДНК в качестве органического гидроксилсодержащего полимера используют аминоатилцеллюлозу, предварительно активированную глутаровым альдегидом, и нрбцесс осуществляют в прнсутствии соответствующего субстрата.2, Способ по п,-1, о т л и ч а ющи й с я тем,что субстрат применяютв количестве 0,20,4 вес,%,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1,0 тлеыч 6.5 01 ее О.А., Аобовеп;.Ь .осбоообоо о 1 Ь 6 Ьообев аооМЯорЬососссз 6 Ммс 1 еое оо 5 ербоое1 готизооосогКеоМ, " Ио 1 ое," 225,189, 1970.2. Куриненко ь. М., Калачева И. В.,Габдуллина Г, К. Стабилизация нуклеазковалентным связыванием с растворимымдекстраном. - Биоорганическаа химия.1(4, 483, 1975 (прототип.Составитель А. БочаровРедактор Т, Киселева Техред Ж. Кастелевич Корректор И. МускаЗаказ 2251/3 Тираж 495 ПодписноеПНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москм, Ж 35, Раушская набд, 4/5филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4