Способ получения д-рибозы

Союз Советскив Социалистических Республик(ЗЗ) Япония50979 Бюллетень М 34 осуаарственный комитет,СССР ио ленам итобретеиий и открытийата опубли вания описания 150979 Иностранцы садэима Мунехару Екота, Есио Накао(72) Авторм нзобретенв ои, Теруо фукухару Масахнко Енеда Кен-Ичи АкИностранная фирма фТакеда Кемикал Индастриз) Заявитель 54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-РИБОЗЫ Изобретение относится к микробиологической промышленности и ка" сается техники получения Р-рибозы.Наиболее близким к описываемому изобретению является известный способ получения Р-рибозы, предусматривакщий культивирование микроорганизмов рода Вас 1 ЙШз на питательной среде с последующим выделениемР-рибоэы 1)Используемые в известном способе микроорганизмы из рода Вас 1 Юйцз обладают довольно низкой 2"дезокси- "Р-гликозной окислительной активностью, составляющей 0,01"0,02 микро моля/мин/мг белка и высокой способностью к спорообраэованию.Указанный известный способ не обес печивает достаточно высокого выхода Ррибоэы.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения Р-рибоэы из рода Вас 1 йсцэ используют микроорганизмы, обладающие по крайней иере одним иэ двух свойств: частотой спорообразования, равной 2 х 10 в -10 или 2-деэокси-Р-глвкоэооксидируюцей активностью, составлякщей 0,05-1,00 микромоля/мнн/мг белка и транскетолазной активностью не более 0,01 микромоля/мин/мг белка или Р-рибулозофосфат-эпимеразной активностью,5 составляющей не более,0,01 микромоля/мин/мг белка, например штаммыВас 1 е,сцз рцв 17 цз 9911 ( РО 12566),9 1027 ( 1 РО 13585) и 9 1083 (1 РО13620), а также Вас 1 есцз зцЬТ 1 Р 1 зО 9 957 (1 РО 13565), 9 941 (1 РО 13573)р9 1054 ( )РО 13586) ) 9 1067(1 РО 13588) и 9 1097 ( 1 РО 13621)и т.д.В питательной среде в качестве - 15 источников углерода ислользуютР-глюкозу, Р-фруктозу, Р-манноэу,сорбит, Р-маннит, сахароэу, мелассу,продукты гидролиза крахмала, крахмал,уксусную кислоту и этанол.ф В качестве источников азота используют органические вещества, например жидкость для эамачиваниязерна (кукурузы), хлопковые отходы,дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, 2 б рыбью муку, мясной экстракт, пептон,казаминокислоту и такие неорганические вещества, как, например,водный раствор аммиака, газообразныйаммиак, сульфат аммония, нитратаммония, хлористый аммоний, карбонатаммония,фосфат аммония, нитратнатрия и т.д., а также такие органические аэотсодержащие вещества, какмочевина, аминокислоты и т.д.Кроме того, в питательную средувводят. также различные металлы, витамины, аминокислоты.и другие росто,вые вещества для микроорганизмов.(в произвольном соотношении).Культивирование микроорганизмовосуществляют в аэробных условиях,преимущественно путем встряхиваниякультуры или погружения культурыпри разбрызгивании и перемешивании,Температуру инкубации выбираютв интервале 20-45 С,в зависимостиот требуемой температуры для ростаиндиввщуального организма и накопления Ь-рвбозы, рН среды 5-9,для поддержания, рн среды в неедобавляют хлористоводородную илисерную кислоту, водный раствораммиака, газообразный аммиак водный раствор гидрооккси ндтрия,карбонат кальция, гашеную известь.Процесс накопления 0-рябовы всреде проводят в течение 2-5 днейо последукщим выделением Ь-рибозы.Культуральную среду фильтруют илицеитрифугируют, Фильтрат обессоливают и обесцвечивают обработкойактивированньаа углем и ионообменнойсмолой, а затем концентрируют.Х концентрату добавляют органический растворитель 6, напримервтюиолу и отделяют кристаллы 0-рибовыеЕ р и м е р 1. Обладающий деФицитом транскетолазы, аспорогеныймутант Р 911 разновидности Вас 13 цзрцзЫьцв (1 р 0,13566), полученнййиз вида Вас 1 ЮВдз рщп 1 Мцв )РО 12113в результате облучения ультрафиолетовыми лучами (транскетолаэная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина и частота,спорообраэования 2 х 10 В),используютдля инокуляцни 10 л среды, содержащей0 сорбита, 2,0 жидности для выиачивания зерна, 0,3 двуэамещенногофосфорнокислого калин, 0,1 первичного кислого Фосфорнокислого калия,100 мг/л тироэина и 100 мг/л Фенил"аланина,Эатем инокулированную среду инку.бируют при 36 С 24 ч и все полученноеколичество культуры переносят в100 мл питательной среди следующегосостава,1 Ь-глюкоза 15,0 сухиедрожжи 1,01 сульфат аммония 0,5 укарбонат кальция 2,01 триптофан50 мг/л пироэин 50 мг/л; Фенилаланин 50 мг/л.На этой среде культивируют при36 С 60 ч. 0-рнбоза накапливаетсясо скоростью 64 мг/мл, Иэ жидкостиферйентации 0-рибоэы клетки удаляют Фильтрацией, Фильтрат концент.рируют до 0,5 первоначального объема добавляют примерно однучетвертую часть этанола и осадоквыбрасывают.Оставшийся раствор обессоливаютна катионо-и анионообменных смолах,а затем обесцвечивают на колонкес активированным углем,Обесцвеченный раствор концентрируют, разбавляют четырьмя объемами этанола, получая 5 кг кристаллической 0 рибоэыП р и м е р 2, Обладающий дефицитом траискетолазы аспорогенный мутантЙ 957 вила Вас 1 РВдз зцЬИВз( 1 РО 13586), полученный иэ видаВас 122 цв зцЬМЯ 1 з РО ., 3026 в резуль 115 тате обработки И"метил-Я-нитронитрозогуанидином (ИТ 6, транскетолаэная активность не более 0,01микромоля/мин/мг протеина и частотаспорообраэования Зх 10 ф ) культиви 2 Д руют так, как описано в. примере 1,0-рибоэа аккумулируется в культуральной жидкости со скоростью62 мг/мл, при этом получают 4,6 кгкристаллической Ь-рибозы, как этоописано в примере 1.П р и м е р Э. Обладающие дефицитом эпимеразы аспорогенный мутант(ГО 13573), полученный из видаВас 1 ЮРцв вцЬИЖз 1 ГО 3026 паслеоблучения ультрафиолетовыми лучами(пимераэная активность не более0,1 микромоля/мин/мг протеина, частота спорообраэования 7 х 10 в), куль"тивнруют аналогично примеру 1,З 5 0-рибоза накапливается со скоростьюпримерно 65 мг/мл, при этом получают 4,3 кг кристаллической0-рибоэн, как это описано в примере 1.П р и м е р 4. Мутант 9 102740 разновидности Вас 1 Рпцз рцщХ Рцз(1 РО 13585), имеющий деФицит транс"цетолаэы и обладающий высокой 2-деэокси -0-гхпоко эооки бдительной акти вностью (транскетолаэная активностьне более 0,01 мнкромоля/мин/мгпротеина, 2-дезокси-глюкоэоокис"лительная активность 0,28 микромоля/мнн/мг протеина), который получениэ вида Вас 122 цз рцв 1 Юцз 1 Р 012092Я) прн облучении ультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описанов примере 1. 0-рибоэа накапливаетсясо скоростью, примерно 63,2 мг/мл,при этом получают 4,8 кг кристаллика ческой 0-рибозы так, как списанов примере 1.П р и м е р 5. Иутант Р 1-054Вас 13,Ецз зцЬ 1 Ив (ГО 13586), обладающий дефицитом эпимераэы и имею, щий высокую 2-дезокси-глюкозоокислительную активность (эпимеразная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина, 2-деэокси"глюкозоокислительная активность 0,31 микромоля/мнн/мг протеина),который получен нз вида Вас 11 цз686631 15 Формула изобретения Составитель Н.БражниковаРедактор Л.Емельянова Техред Н,Бабурка Корректор Е,Папп Заказ 5366/57 Тираж 526 Подпи сн ое 1(НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Провктная, 4 яцЪ 11 Й 1 я )ГО 3026 обработкой Б-метил-М -нитро-И-нитрозогуанидином, культивируют, как описано в примере 1.О-рибоза накапливается со скоростьюпримерно 65,7 м 1 /мл, при этом получают 5,1 кг кристаллов О-рибозы, 5как описано в примере 1,П р и м е р б. Мутант 9 1067 видаВас 1 Иця яцЪе 191 яГО 13588, обладающий дефицитом транскетолаэы,имеющий высокую 2-деэокси-О-глюкозоокислительную активность (транскето"лазная активность - не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина, 2-дезокси-О-глюкозоокислительная активность0,33 микромоля/мин/мг протеина),который получен из вида Вас 1 0 йцвяцЬ 1 Р 1 я (ГО 3026 обработкой Ю-метил.;И -нитро-И-нитрозогуанидином, культивируют так, как описанов примере 1. О-рибоза накапливается со скоростью примерно 66,5 мг/мл, 20при этом получают 5,3 кг кристалловО"рибозы, как это описано в примере 1.П р и м е р 7. Обладающий дефицитом транскетолазы и имеющий высокую2-дезокси-О-глюкозоокислительнуюактивность аспорогенный мутант9 1083 вида Вас 122 ця ршп 1 йця 8-11 ГО .13620 (транскетолазная активность не более 0,01 микромоля/мин/мгпротеина, частота спорообраэования4 х 10 а , 2-дезокси-О-глюкозоокислительная активность 0,34 микромоля/мин/мг протеина, который получениз вида Вас 1 Р 1 цз рцщ 1 Вця облучениемультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описано в примере 1. Скорость накапливания О-рибозы-72,3 мг/мл, при этом получают 5,6 кгкристаллической О-рибозы, как описаво в примере 1,П р и м е р 8, Обладающий дефицитом транскетолазы аспорогенный иимеющий высокую 2-дезокси-О-глюкозоокислительную активность мутант9 1097 Вас 1 ййця яцЫ 111 я 1 ГО 13621(транскетолаэная активность не более 450,01 микромоля/мин/мг протеина,частота спорообразования Зх 102-деэокси-О-глюкоэоокислительная активность - О, 29 мккромоля/мин/мг протеина), полученный из вида Вас 11 Ь:яяцЬ 121 я 1 ГО 3026 облучением. ультра.фиолетовыми лучами, культивируют,как описано в примере 1. О-рибозанакапливается со скоростью примерно 706 мг/мл, при этом получают5,4 кг кристаллической О-рибозы,как описано в примере 1.Предлагаемый способ обеспечиваетпо сравнению с известным способомповьаденный выход целевого продуктаэа счет способности используемыхмикроорганизмов накапливать О-рибозу со скоростью 65-70 мг/л,тогда как в известном способе скорость накопления О-рибозы равнав лучшем случае 35,3 мг/мл.Преимуществом предлагаемого способа является также пониженная способностью микроорганизмов к спорообразованию, благодаря чему не требуется специальной методики удаленияспор. Способ получения О-рибозы, предусматривающий.культивированйе микроорганизмов рода Вас 12 йя на питательной среде с последующим выделением О-рибозы, о т л и ч а ю Щ и йс я тем, что, с целью повьааения выхода целевого продукта, иэ рода Вас 1 ЯВця используют микроорганизмы, обладающие по крайней мере одним из двух свойств: частотой спорообраэования, равной 2 10 -1 0 ,или 2-деэокси-О-глюкозооксидирукщей активностью, составляющей 0,05-1,00 микро- моля/мин/мг белка,н транскетолаэной активностью не более,чем 0,01 микро- моля/мин/мг белка или О-рибулозофосфат 3-эпимеразной активностью, составляющей не более,чем 0,01 мнкромоля/мин/мг белка. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании 91255254,кл. С 2 С, опублик. 1971.