Стимулятор репродукции парагриппозных вирусов

фСЕООЮЭН, , О и И С А И-И Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Сеез Сфеетскввх Соцтвалмстическтвх Республнтв(43) Опубликовано 150678. Бюллетень йв 22 (53) М. Кл. С 12 К 7/00 Геарщвтааааяа аеяатет еевета Вааавтреа ВФР ае нааа авееретааа 3 а етармтаа(45) Дата опубликования описания 200578 О,В.Давыдов и Т.В.Карпова(7) Заявитель Белорусский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии(54) СТИМУЛЯТОР РЕПРОДУКЦИИ ПАРАГРИППОЗНЫХ ВИРУСОВИзобретение относится к вирусологии, а именно к .веществам, способст" вующим накоплению вирусов в заражен ных клетках.Известно использование лнпидных экстрактов в качестве ингибиторов вирусной активности Ц .Целью изобретения является расширение арсенала средств, стимулирующих репродукцию вирусов.Эта цель достигается применением липидных экстрактов в качестве стимулятора репродукции парагриппозныхвирусов.П р и м е р 1. Применение липидного экстракта из печени крысы для сти- муляции репродукции парагриппозного вируса 1 типа.К 5 г гомогената печени крысы добавляют 5 мл дистиллированной воды,2 мл 96-ного этилового спирта, доводят рН образца до 12 1 н, растворомКОН и помещают на 2 час на кипящуюводяную баню.К полученному образцу добавляют 5 мп петролвйного эфира, встряхивают 5 мин и удаляют органическую фазу. Процесо экстракции петролейным эфиром повторяют, удаляют органическую фазу и к оставшейся в пробирке водной фазе (гомогенат) добавляют 10 мл смеси 96-ного этилового спирта ихлороформа, взятых в отношении 1:3.Пробирку встряхивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний слой (хлороформный экстракт) и испаряют встерильных условиях. Сухой остатоклипидов эмульгируют в 5 мл 5-ногораствора гемогидролизата и приготавливют рабочее разведение эмульсии 1:5на той же питательной среде.В пробирки с культурой клеток первично - трипсинизированной почки эмбриона человека в опыте вносят по 0,1 мпвирусосодержащей жидкости парагриппа 151 типа (штамм СС 1889) с исходным титром 3 ед.03 /0,1 мл, 0,1 мл рабочегоразведения эмульсии липидов и 0,8 мл5-ного раствора гемогидролизата, Вконтроле вместо эмульсии используют5-ный гемогидролизат,После 5-дневной инкубации при 37 С и трехкратного замораживания н оттаивания проводят титрование инфекционности полученных образцов в объеме 0,1 мл на ткани первично-трипс.низированной почки эмбриона человека,В образце вируса, репродуцированного с добавлением липидного экстракта, инфекционность составляет. Добавление в питательнуь средуэмульсии липидов из ткани печени крысы повышает выход инфекционного пФрагриппозного вируса 1 типа на 2,17 бд(Р5 оФ.е, в 14 ь раэ.П р и м е р 2. Применение липидного экстракта из печени крысы для стимулирования репродукции парагриппозного вируса 1 типа.К 5 г гомогената печени крысы добавляют 5 мл дистиллированной водыи 10 мл смеси 96-ного этилового спирта и хлороформа, взятых в отношени1:3. Образец встряхивают 30 мин,центрифугируют, отделяют нижний слой.(хлороформный экстракт) и испаряют егодо объема,1 мл, К полученному концентрированному экстракту липидов добавляют 10 мл холодного (+4 С) ацетона и 20оставляют при этой температуре на24 час, Выпавший белый осадок липидонотделяют центрифугированием при1000 об/мин н течение 1 мин и растворяют в 5 мл хлороформа, ХлороФорм испаряют в стерильных условиях и эмульгйруют сухой остаток в 5 мл .5-ного раствора гемогидролизата.,В опытные пробирки с культуройклеток пернично" трипсинизированной 30почки эмбриона человека вносят по0,1 мл вирусосодержащей жидкости парагриппа 1 типа (штамм СС=1889) с исходным титром 3105/0,1 мл,0,1 мл эмуль"гированных липидов в разведении 1:5на растворе 5-ного гемогидролизатаи 0,8 мл раствора 5-ного гемогидролиэата. В контроле липидный экстрактзаменяют раствором 5-ного гемогидролизатаНа пятый день инкубирования при 4"37 С пробирки подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и титруют инфекционность полученных образцов н объеме 0,1 мл на.ткани первично-трипсинизированной почки эмбриона 45человека.В образцах с добавлением эмульсиилипидон инфекционный титр вируса составляет 6,776З /0,1 мл, а в конт"роле 5,331(Р, /0,1 мл. 50Добавление. в культуральную жидкость экстракта липидов из печеникрысы повыаает выход инфекционноговируса парагриппа 1 типа на 1,44 цОВт.е, н 28 раз. 55П р и м е р 3. Применение липидного экстракта из почки крысы для стимулирования репродукции парагриппозноговируса 3 типа.К 5 г гомогената почки крысы добавляют 3 мл дистиллированной воды 2 мл96-ного этилового спирта, 1 н. раствор КОН до рН 12 и помещают на кипящую водяную баню на 2 час. К полученному образцу добавляют 5 мл петролейного эфира, встряхивают 5 мин и удаляют органическую фазу, Экстракциюпетролейным эфиром повторяют, органическую фазу удаляют, а к водной (гомогенату) приливают 10 мл смеси 96-ногоэтилового спирта и хлороформа (1:3) .Пробирку встряхивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний прозрачныйслой (хлороформ) и испаряют его встерильных условияхСухой остаток эмульгируют в 5 млраствора поддерживающего гемогидролизата.В пробирки с культурой клеток первично-трипсинизированной почки эмбриона человека вносят по 0,1 мл пара"гриппозного вируса 3 типа (штамм ВОК)с исходным титром 0,5 ЕдОР /0,1 мл0,1 мл эмульгированного липидного экстракта в разведении 1:10 и 0,8 мл раствора поддерживающего гемогидролйзата.После 5-дневного инкубиронания при37 С пробирки трижды заморажинают иоттаивают и титруют инфекционностьпслученных образцов в объеме 0,1 млна монослое первично-трипсинизированной почки эмбриона человека.В образцах с добавлением эмульсиилипидов инфекционный титр вируса равен 5,336 цОЭ/0,1 мл, в контроле3,23 ЯГОР,/0,1 мл,Добавление в культуральную жидкость экстракта липидов из почкикрысы повьпйает выход инфекционноговируса парагриппа 3 типа на 2,10 г 02 ь,т,а. н 126 раз.П р и м е р 4. Применение липидного экстракта из подсолнечного масладля стимулирования репродукции парагриппозного вируса 1 типа.К 1 г подсолнечного масла добавляют 2 мл 1 н. раствора ЙООН,2 мл 96-ногоэтилового спирта, помещают образец на кипящую водяную баню на 2 час.Верхний слой образовавшейся двух"фазной системы удаляют и к оставшейсяводной фазе добавляют 5 мл петролейного эфира, встряхивают 5 мин и удаляют верхний слой образовавшейся двух"фазной системы (органическая фаза) .Экстракцию петролейным эфиром повторяют, удаляют органическую фазу, доводят рН водной фазы до 7 и добавляют 10 мл смеси 96-ного этиловогоспирта и хлороформа, взятых в соотношении 1;3. Пробирку встряхивают 30 мин,центрифугируют, отделяют нижний слой(хлороформный экстракт) и испаряютего н стерильных условиях, сухой остаток эмульгируют в 5 мл 5-ногораствора гемогидролизата,В пробирки с культурой клеток первично-трипсинизированной почки эмбриона человека вносят по 0,1 мл вируса парагриппа 1 типа (штамм СС 1889) с исходным титром 0,58 д.ОР /0,1 мл, 0,1 мл эмульсии липидов и разведении 1:5 на 5-ном растворе гемогидролизатй,610864 Формула изобретения Составитель С,МалютинаТехред М. Борисова Корректор Н.Ковалева,Редактор Е.Корина Заказ 3097/21 Тираж 568 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва,. Ж, Раушская наб., д,4/5 Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 0,8 мл 5-ного раствора гемогидролиэата.Через 5 дней инкубирования при 37 фС образцы три раза эамораживают и оттаивают, титруют инфекционность н объеме 0,1 мл.В образцах вируса, прошедшего инкубацию в присутствии эмульсии липидон подсолнечного масла, инфекционный титр ранен 5 ЕгОЗ /0,1 мл. В контроле (без добавленйя эмульсии) титр ви руса составляет 3,67 ЕгОЭщ /0,1 мл.Культивирование вируса н присутствии липидон из подсолнечного масла повышает его титр в 21 раэ,П р и м е р 5. Применение липидного)5 экстракта из почки кролика для стимулирования репродукции парагриппоэного вируса 2 типа.К 5 г гомогената почки кролика добавляют 5 мл воды и 20 мл смеси этило- Э ного спирта и хлороформа (1:3), встря, хивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний слой (органическую Фазу) и испаряют его в стерильных условиях. Сухой образец эмульгируют в 5 мл раствора поддерживающего гемогидролизата25 и вносят его в объеме 0,1 мл в пробиркиьки с клетками первично-трипсинизи- рованной почки человека зараженны24 чФ ныечас назад вирусом парагриппа 2 типа. Для заражения клеток в пробирки вносят вирусосодержащую жидкость с исходным титром 1,33 ед 02 о/0,1 0,8 мл поддерживающего гемогилролизата.Пробирки инкубируют прн 37 С н теь чение 4 дней, извлекают, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и титруют инфекционность полученных образцов в объеме 0,1 мл на ткани пернично-трипсинизиронанной почки эмбриона человека.,В образце с добавлением эмульсии липидов инфекционный титр вируса составляет 4,77 и н контроле 3,502 /0,1 млДобавление в культуральную жидкость экстракта липидов из почки кролика повышает выход инфекционного вируса парагриппа 2 типа в 19 раз.Применение липидных экстрактов в качестве стимуляторов репродукции пара- гриппозных вирусов позволит унеличирать урожаи вирусон в 10-1000 раэ посравнению с вариантами беэ стимуляторов. Применение липидных экстрактов в качестве стимулятора репродукции парагриппозных вирусов.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1.СаэаЕе. Ехре 1 тепЕ 1 ае мопедс 1 иь.99, 1954, р.429-449,