Способ получения ацилазы 1

(ш 572495 Союз Советских Социалистических Республик61) Дополнительное к22) Заявлено 19.12,75с присоединением авт. свид-ву21) 2301726/13 51) М Кл,-" С 12 Р 13,1 а явки,Государственимй комитетСовета Мииистрсв СССРве делам изобретенийи открытий 3) Приоритет Бюллетень34(088.8) публиковапо 15.09.7 ата опубликования описания 20.10,77(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦИЛАЗЬ тся к области техничеа именно к способам ацилазы 1, применяемой еской химии и медициически активных аминоокислот, которые широродном хозяйстве. Изобретение относиской микробиологииполучения ферментав прикладной органичне для получения опткислот и Р-ациламинко используются в на эроб, нс растет а белковых среОкисляет безИзвестен способ получения ацилазы 1 путем культивирования микроогранизмов рода 10 Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсцгп на питательной среде, содержащей источник углерода и серно- кислый магний, при рН 7,2 - 7,5, отделения биомассы и выделения ацилазы 1 11. Продуктивность применяемого штамма низка, ис пользуется сравнительно дорогая среда.Целью изобретения является повышение выхода целевого фермента и ускорение процесса.Для достижения поставленной цели из 20 микроорганизмов рода Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсцгп используют штамм 636, при этом в питательную среду вводят калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, каль ций хлористый, железо хлористое, марганец хлористый, натрий молибденовокислый и борную кислоту,Штамм Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсшп 636 имеет следующие характеристики, 30 Штамм Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсцгп 636 получен из коллекции музейных культур кафедры микробиологии МГУ в 1969 г.Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсшп 636 представляет собой микроорганизм, способный развиваться на безазотистых питательных средах и прп интенсивной аэрации фиксировать азот атмосферы. Культура также способна использовать связанные формы азота в низких концентрациях. Добавки минерального плп органического азота в питательную среду депствуют как антагонисты к связыванию атмосферного азота.Морфологические свойства, Имеет клетки различной величины, от палочковидных до кокковидных, Молодая клетка представляет собой толстую, подвижную палочку размером 2,0)(1,2 мкм. Взрослая клетка становится круглой или овальной и уменьшается в размерах (1,5(1,2 мкм), Эти мелкие клетки, выделяя плотную капсулу (вещество, которое окутывает клетку и находится в непосредственном контакте с ней), превращаются в цисты, представляющие собой покоящиеся формы. Штамм отрицательный по Грамму, клетки образуют пигмент от бело-желтого до буровато-черного цвета.Физиологические свойства, Аили проявляет слабый рост ндах при низких пределах рНазотистые органические вещества до СО, и НО. Углеродное питание штамма характеризуется сбра)киваиием моно-, ди-, полисахаридов, спиртов и органических кислот. Из последних слабо используют бензойиую, гиппуровую кислоту, а так)ке некоторые аминокислоты - глицин, триптофан, лейцин, валин, тирозин,Зона роста культуры лежит в пределах рН 6,0 - 9,5, оптимум роста при рН 7 - 8, температуре 26 - 28 С. Культура имеет дезаминирующие способности; для лабораторных животных нс патогенна. Изобретение обеспечивает повышение выхода бионассы (25% выше известного) зд счет более высокой продуктивности штамма, обеспсчива 1 ощего направленный биосинтез ацилдзы. Упрощение процесса достш астся тем что сокращется дли сльиос 1 Ь п)оцес" сд - штамм 636 развивается ид простой питательной срсдс, обеспечивающей ускорение обмена всщсств в клетке и сокращение цикла )дзвити 51 клстки. Коисц лОГ 1)ифмисск 01 фазы развития клетки кдк период оптимального накопления фермента ацилазы 1 приходится на 30-й час культивирования. В силу изменения азотного литания клетки получаемый фермент обладает широким спектром специфичности по отношению к ациламинокислотам: И-ацетил-й-метионину, М-ацетил- Ж-аланину, Х-ацетил-й-серину, М-ацетил-Й- фенилглицину, Х-хлорацетил-Н-фенилглицинБиосинтез фермента ацилазы 1 штаммом636 совершается путем биологической фиксации азота атмосферы, т, е. метаболизм штамма 636 отличается от известного, развитие которого происходит на аминном и неорганическом азоте. Фосфорное питание обеспечивается фосфатами. Фосфаты совместно с ионами Са+ буфирируют среду, поддерживая желаемый рН, В условиях интенсивной аэрации углевод (глюкоза или сахароза) обеспечивает углеродное питание клетки и является источником энергии.Предлагаемый способ заключается в следуюш,ем.Для получения фермента ацилазы 1 выращивают Аго 1 ОЬас 1 ег сЬгоососспгп 636 на минеральной среде с 1,5 - 2% углевода. Среда обеспечивает потребность микроорганизма в фосфоре, углероде, микроэлементах и энергии. Особенности штамма и интенсивная аэрация определяют азотное питание при помощи биологической фикции азота. Ферментация культуры производится при 27 С в аэробных условиях (2 л воздуха на 1 среды) в течение 30 час.Выход биомассы 25,0 г/л.Активность ацилазы, ед, на 1 мл культуральной жидкости, к субстратам:К-ацетил-Ю-метионин 26,7 М-ацетил-Л-алании 30,1 М-ацетил-Ж-серии 25,855 6065 5 10 15 30 35 40 45 50 И-дцетил-Й-феиилглицин 13,5 М-хлорацетил-Й-фенилглицин 16,1После ферментации биомассу отделяют центрифугированием, промывают физиологическим раствором и подвергают замораживанию, лиофилизации или обработке ацетоном. Активность такой ацилазы сохраняется до 6 месяцев без потерь и ее можно применять для ферментативного гидролиза ациламинокислот,При м е р 1. В качестве продуцента ацилазы 1 используют культуру Аго 1 ОЬас 1 ег СЬгоососсцгп 636. Биосинтез фермента штаммом производится на следуОшей питательной среде (г/л):Калий фосфориокислый однозамещеиный 1,5Калий фосфориокислыйдвузамсщсниыйМагний сериокислый 0,1 Натрий хлористый 1,8 Кальций хлористый 2,0 )Кслезо хлористос 0,01 Марганец хлористый 0,01 Натрий молибдсновокислый 0,01 Бориая кислота 0,002 Углевод (глюкоза, сахароза) 15,0 Глюкозу (1,8/о - 360 г/л) готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и стерильно добавляют к ферментационному раствору. Культуру Аго 1 ОЬас 1 ег сЬгоососсцгп 636 поддерживают на 2/о-ной агаризованной синтетической среде. Используют культуру после 48 час выращивания на косом агаре, потом пересеивают в колбу с 100 мл жидкой питательной среды, ставят на качалку при 27 С иа 24 час (логарифмическая фаза развития клетки). Приготовленный посевной материал используют для инокуляции ферментаций - с расчетом 10 мл клеточной суспензии на 1 л питательной среды, Ферментацию культуры производят при 27 С с аэрацией (2 л воздуха иа 1 л питательной среды) в течение 30 час.Во время ферментации контролируют прирост биомассы, рН, температуру среды, степень аэрации и активность ацилазы в культуральной жидкости.Активность ацилазы, ед. на 1 мл культу- ральной жидкости, к ациламинокислотам;К-ацетил-Л-метионин 24,6 Х-ацетил-Й-алании 31,2 К-ацетил-Й-серии 33,0 Х-ацетил-Ж-фен илглицин 1 1,2 1 Ч-хлорацетил-Л-фенилглицин 13,4 Выход биомассы 26,5 г/л. Ф ор мул а изобретенияСпособ получения ацилазы 1 путем культивирования микроорганизмов рода АгоОЬас 1 ег сЬгоососсшп на питательной среде, содержащей источник углерода и сернокислый магний, при рН 7,2 - 7,5, отделения биомассы и выделения ацилазы 1, отл ич а ющийся тем, что, с целью повышения выхода целево.872495 Составитель Т. Серебренникова Редактор Е. Хорина Тсхред М. Семенов Корректор Л. Денискина Заказ 2221/14 Изд.763 Тираж 564 1-1 ПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 го фермента и ускорения процесса, из микроорганизмов рода Аго 1 оЬас 1 ег сЬгоососсцгп используют штамм 636, при этом в питательную среду вводят калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, кальций хлористый, железо хлористое, марганец хлористый, натрий молибденовокислый и барнуюкислоту. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Японии Мо 8635, кл. 36/2 35 серия 1. Сборник 426, 1970.