Способ получения люциферазы светляков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 113391 1)4 С 12 И 9/02 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(56) ВгапсЬпз. В, К МагэсЬпег Т, ММопСощцгго А, М, А сопчеп 1 епг аГГ 1 п 1- гу сЬгошагодгарЬУ Ьазепд оп рцг 1 Е 1- саггоп оГ 11 геНУ 1 цс 1 Гегазе Апа 1 У 1.са 1 В 1 осЬепцсггу, - 1980, ч, 104,рв 386-396,Вепу В, М Ро 1 ыо М, Ггасг 1 опаг 1- оп ой Й 1 геНУ 1 цс 1 Гегазе оп ап 1 опсЬапаегз. - РЕВЯ 1.еггегз, 1976, ч, 70,У 1, р. 167-170,Филиппова Н, Ю Духович А, ФБукатина В. А Угарова Н, Н, Аллостерический механизм регуляции активности люциферазы из светляков 1.цс 1- о 1 а ш 1 пдге 11 са. - Биохимия, 1984,т. 4, с, 1965-1972,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЮЦИФЕРАЗЫСВЕТЛЯКОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения люциферазы светляков. Цельизобретения - увеличение активностии стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе, Лампочки светляков растирают с карборундом, инкубируют в буферном растворе содержащем 0,3-0,8 М минеральной соли, 15-257 глицерина или 0,20,4 М сахароэы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовоесоотношение лампочки светляков:буферный раствор составляет 1;(8-30), Осадок отделяют, а надосадочный растворподвергают дифференциальному ультрацентрифугированию сначала 15-45 минпри 15-30 тыс. я, затем 1-2 ч при140 тыс. а. Активность полученногорастнора 1,0 1 О Э мВ/мл, удельная активность 13 10 мВ/мг белка. Прихранении при 4 С в растноре в течение месяца препарат сохраняет 507 активности. 4 зи. ф-лы.Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получениялюциферазы светляков,Цель изобретения - увеличение активности и стабильности люциферазыи повышение ее концентрации в растворе,Способ осуществляют следующим образом,Лампочки светляков измельчают растиранием, которое целесообразно проводить в смеси с охлажденным карборундом, что повышает степень измельчения, Полученный порошок инкубируютв 0,1 М фосфатном или трис-ацетатном буферном растворе с рН 7,8. Используемый буферный раствор содержитО, 3-0, 8 М минеральной соли, обычно исПользуемой при работе с ферментами,например хлорид калия или натрия,азотнокислый натрий, а также 15-257,глицерина или 0,2-0,3 М сахарозы вкачестве стабилизирующих люциферазу добавок. Соотношение лампочкисветляков:буферный раствор 1:(8-30).Инкубирование ведут 12-24 ч при 4 С,Наличие в буферном растворе высокойконцентрации соли и стабилизирующихдобавок стабилизирует люциферазу испособствует более полному выделениюфермента в раствор иэ исходного сырьяПри использовании концентрации соли и стабилизирующих добавок нижеуказанных снижаются стабилизирующийэффект буферного раствора и степеньизвлечения фермента из исходного сырья, Использование концентраций вышемаксималЬных не приводит к дополнительному положительному эффекту, однако повышает вязкость растворов изатрудняет работу при пониженной температуре, Использование при инкубировании более высокого соотношениялампочки светляков:буферный раствор,чем 1:30, приводит к разбавленнымрастворам фермента и снижению положительного эффекта изобретения, апри использовании соотношения менее,чем 1:8, приводит к неполному извлечению люциферазы иэ исходного сырья.Длительность инкубирования менее12 ч приводит к неполному извлечениюлюцифераэы, а при длительности инкубирования более 24 ч не достигаетсядополнительный положительный эфФект,однако неоправданно увеличиваетсядлительность всех операций полученилюциферазы,После инкубирования смесь центрифугируют при 3000 я 5-15 мин для отделения раствора от осадка. Последний смешивают с новой порцией буфер 1)ного раствора, перемешивают 2040 мин, вновь центрифугируют, затемобработку осадка повторяют. Три порции буферного раствора, содержащиелюциферазу, объединяют и очищают отбалластных веществ дифференциальнымультрацентрифугированием, сначалапри 20000-30000 я 15-45 мин, а затемпри 14000 я 1-2 ч, Получают надоса 15 дочный раствор, который содержит люциферазу с активностью (3, 3-10)10 мВ/мли удельной активностью (1,6-13)10мВ/мг. Укаэанный режим дифференциального ультрацентрифугирования не является существенным признаком предлагаемого изобретения, алишь предпочтительным, так как положительный эфФект, т,е, повышение активности и стабильности люциферазы,25 может быть достигнут и при использовании других режимов дифференциального ультрацентрифугирования, аименно: при центрифугировании в одну стадию при 140-150 тыс, я в течение 3 ч, либо при центрифугировании в три или четыре стадии по 30 минпри 15, 50, 100 и 140 тыс, д, Однаково всех этих случаях увеличиваетсяпродолжительность и трудоемкость про 35цесса получения люцифераэы.В результате очистки методом дифФеренциального ультрацентрифугирования достигают 10-кратной очистки фермента от балластных веществ. Такимобразом, получают препарат люциферазы, удельная активность которого в200-2000 раэ выше, чем активность препарата, получаемого по известному способу, а концентрация активной люцифера 45зы выше в 40-130 раз, Полученный попредлагаемому способу препарат люциферазы отличается высокой стабильностью. За счет стабилизирующего воздействия буферного раствора, исполь 50эуемого при выделении фермента, непроисходит инактивация люцифераэы входе очистки. Полученный препаратопри 4 С хранят 30 дн, при этом активность люцифераэы уменьшается только в 2-3 раза,55П р и м е р 1. 2,2 г лампочексветляков растирают в смеси с 14 гкарборунда 20 мин при 4 С, затем добавляют 5 мл охлажденного 0,1 М трис15 3339ацетатного буферного раствора, рН 7,8,содержащего 0,6 М КС 1, 20 . глицерина,и растирают еще 20 мин, Добавляют17 мп того же буферного раствора ио5инкубируют 18 ч при 4 С, Таким образом соотношение лампочки светляков:буферный раствор 1:1 О, Смесь центрифугируют при 3000 д 10 мин, отделяютраствор, к осадку добавляют 20 млсвежего буферного раствора того жесостава, инкубируют 30 мин, вновьцентрифугируют, Последнюю операциюинкубирования и центрифугиронанияповторяют, Три порции полученногонадосадочного раствора объединяют ицентрифугируют 30 мин при 25000 я,осадок отбрасывают, а надосадочнуюжидкость центрифугируют при 1400001,5 ч, Получают надосадочный раствор,который содержит люциферазу с активностью 1,0 10 мВ/мл и удельной ак 9тивностью 131 О мВ/мг белка, Степеньочистки исходного экстракта последифференциального ультрацентрифугирования состанляет 16 раз. При хранеонии при 4 С в растворе 30 сут, препарат сохраняет 50% актинности, По известному способу получают препаратлюцифераэы с активностью 7,5 10 мВ/мл, ЗОудельной активностью 8 10 мВ/мг, Прихранении препарата при 4 С он полностью теряет активность за 1 О сут,П р и м е р 2, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но инкубиро 35ванне проводят н буферном растворе,содержащем 0,3 М МаС 1, 1 Оглицерина,при несовом соотношении лампочкиснетлякон:буферный раствор 1;30 в течение 12 ч, Дифференциальное ультра Оцентрифугирование проводят сначалапри 15000 я 15 мин, а затем при140000 И 1 ч. Получают препарат люциферазы с активностью 3 1 О мВ/мл иудельной активностью 35 1 О мВ/мг45белка, При хранении в растворе при4 С препарат сохраняет через 30 сут35 активности,П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1 но инкубиро 950нание проводят н буферном растворе,содержащем О, 8 М ХаЮ и 25 глицерина, при соотношении лампочки светляков:буферный раствор 1:8 24 ч, адифференциальное ультрацентрифугиро 55вание проводят 45 мин при 30000 я,затем при 40000 я 2 ч, Получают препарат люпиферазы с активностью 3,31 О мВ/мл и удельной активностью 12841,6 104 мВ/мг белка. 11 олученный препарат при хранении в растворе при4 С через 30 сут, сохраняет 45 активности,П р и м е р 4. Все операции осуществляют аналогично примеру 1, ноинкубиронание проводят в буферномрастворе, содержащем нместо глицерина различные концентрации сахарозы:0,2, 0,25 и 0,3 М. Получают препараты люцифераэы с активностями5 10 , 10 10 и 6 10 мВ/мл соответственно, Удельная активность препарата люцифераэы, полученного прииспользовании 0,25 М сахаоозы, 10 ".О мВ/мг белка. Степень очисткиисходного экстракта после дифференциального ультрацентрифугирования16,5 раз. При хранении при 4 С врастворе через 30 сут препарат сохраняет 502 активности.П р и м е р 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но растирают лампочки светляков без карборунда и инкубирование осуществляют в0,1 М фосфатном буферном растворе.Получают препараты люциферазы с активностью 0,5 10 мВ/мл. Препаратсохраняет 50 активности через 30 сут.хранения при 4 С,П р и м е р 6, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но ультрацентрифугирование проводят 3 ч при150 тыс. я, Активность полученногопрепарата 0,7 10 мВ/мл. Препаратсохраняет 50 активности через 30 сутхранения при 4 С,П р и м е р 7, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но ультрацентрифугиронание проводят последовательно при 15, 50, 100 и 140 тыс,по 30 мин. Активность полученногопрепарата 0,5 -10 мВ/мл, Препаратсохраняет 40 активности через 30 сут.хранения при 4 С. П р и м е р 8, Препарат, полученный аналогично примеру 1, используют для определения низких концентраций АТф, Для этого в кювету для измерения,биолюминесценции помещают 0,9 мл 0,1 М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,8, 0,1 мп О, М МАМБО в том же буферном растворе, 0,15 мл раствора, содержащего АТФ, 0,2 мл раствора полученного препарата люцифераэы, предварительно разбанленного в 30 раэ буферным раствором указан1339128 свечения 1. Разность 1-1, характеризует интенсивность свечения анали-, зируемого образца АТФ 106 зцИспользуя растворы, содержащие различные концентрации АТФ, получают следующую зависимость: Концентрация АТФв измеряемой смеси, М О-" О-" О1 О100,8 1,4 3,8 39,4 326,4 обреа цпПолученные данные используют дляпостроения калибровочной кривой дляопределения неизвестных концентрацийАТФ.Таким образом, предлагаемый способ получения люциферазы позволяетполучать препараты люциферазы с20удельной активностью, в 200-2000 разпревышающей активность известныхпрепаратов, при этом концентрациялюцифераэы в растворе увеличиваетсяв 40-130 раз,25Стабильность полученного растворимого препарата люцифераэы в десяткираз превышает стабильность всех известных растворимых препаратов люциферазы. Дополнительным положительнымэффектом предлагаемого способа получения люциферазы светляков являетсяувеличение чувствительности определения АТФ с использованием полученного препарата люциферазы, Предел обнаружения АТФ с помощью полученногопрепарата 10 " М,Формула изобретения 1, Способ получения люцифераэы40 светляков, предусматривающий измельчение лампочек светляков, инкубирование полученного порошка в буферном растворе, отделение твердого осадка и очистку от балластных веществ, о т -45 л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цеСоставитель Т. МелентьеваРедактор И. Горная Техред М,Дидык Корректор И. Эрдейи Заказ 4183/11 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно- предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ного состава, Смесь перемешивают, помещают в кюветное отделение люминометра, измеряют фоновую интенсивностьсвечения 1 ф затем добавляют 0,15 мл0,1 мМ люциферина в том же буферномрастворе и измеряют интенсивность лью увеличения активности и стабильности люциферазы и повышения ее концентрации в растворе, для инкубирования используют буферный раствор,содержащий 0,3-0,8 М минеральной соли, 15-25 глицерина или 0,2-0,3 Мсахарозы в качестве стабилизирующихдобавок, при этом массовое соотношение лампочки светляков:буферный раствор устанавливают 1:(8-30), а очистку от балластных веществ осуществляют дифференциальным ультрацентрифугированием.2, Способ по п, 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что инкубированиеосуществляют в течение 12-24 ч в0,1 М трис-ацетатном буферном растворе,3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что дифференци"альное ультрацентрифугирование проводят сначала при 20-30 тыс. а втечение5-45 мин, а затем при 140 тыс. яв течение 1-2 ч,4, Способ по пп, 1-3, о т л ич а ю щ и й с я тем, что лампочкисветляков измельчают в смеси с карборундом,5. Способ по п. 1, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что в качестве ми" неральной соли используют хлорид калия или натрия, или азотнокислый натрий.