Штамм бактерий sтrертососсus faecalis продуцент рестриктазы sfa n

ИСА Е БРЕТЕН Р К ьскии конс Ъ институт веществДегтярев,суни Н.И. Речьство С /12, 19 тки-ввожи но- ос 55а Я 1,тельщеГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ иииииииииии и иииииии ГНИ ГКНТ СССР,ти к обнаружению микроорганизма,способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу и расщепляющуюпоследоватепьность нуклеотидов ССАТС7Целью изобретения является выявление штамма БстерСососсцв Йаеса 1 вВКП 1 В(555), продуцирующегорестриктазу Ба В 1 с повышенным выходом.Штамм БСгерСососсив Гаеса 1 в 5В- продуцент рестриктазы БЕузнаюцей и раСцепляюцей последованость нуклеотидов ССАТС 1/Н, вьлен в результате селекционной работыс музейными культурами,Штамм характеризуется следующимисвойствами,8016452 1)5 С 12 Б 1/20, 9/1(54) 11 ТАй БАКТЕРИЙ БТГЕРТОСОССБРАЕСА 1 Б - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗИБРА 111(54) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цельюизобретения является шявлениештамма Бгерососсцв 1 аеса 11 в ВКПМВ(555), продуцируюцего рестриктазу Б 2 а Н 1 с повышенным выходом,1 тамм получен в результате селекционной работы с музейными культурами,растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает выход из 1 г влажной биомассы 2000 ед. Фермента, чтов 3 раза больше, чем известного. Иорфологические. Кле иде слегка овальных мелких грампол тельных неподвижных кокков, располагающихся поодиночке, попарно или в. виде коротких цепочек. На плотной питательной среде формируют мелкые диаметром до 1 мм, слегка выпуклые, круглые с ровным краем, блестящие, полупрозрачные пастообразной консистенции колонии. При росте в питательном бульоне - равномерное помутнение.Физиологические и биохимические, В первые сутки вырастает при темперао туре 45 С, на вторые - при 10 С, Растет при рН 9,6 и в молоке в присутствии 0,17. метиленового синего, вызывая его редукцию. Растет на питательном агаре в присутствии теллурита калия, который при этом восстанавливается. На средах Гисса вызыва 1645293ет Ферментацию без газообразованиямелибиозы, маннозы, галактозы, глю"козы, лактозы, сахарозы, мальтозы,арабинозы, маннита. Не ферментируетрамнозу, рафинозу, трегалозу, крах,мал, инозит, дульцит. Ферментнруетв аэробннх и не рерментирует в анаэробных условиях глицерин. Проба смалонатом отрицательная. Индол, сероводород не образует. Дает отрицательные реакции с метиповым красным и наацетон, оксидазу, каталазу и уреазу.Нитраты не редуцирует. Желатин негидролизует, не обладает лизин- и 15орннтнндекарбокснлазой, проба нааргининдигидролаэу положительная.Отношение к антибиотикам. Клеткиустойчивы к пенициллинуампицнллину,ионоиицину, канамицину, оксициллину, 20ристомицину, сульфатиазолу, иетициллину чувствительны к стрептомицину,неомицину, олеандромицину, эритромицину, иовобиоцину, гентамицнну и рняампицинуо 25Цтаим хранится в лиофильно-высушенном состоянии и на полужидкойпитательной среде под слоем вазелинового масла.Для культивирования клеток применяется питательная среда следующегосостава, г/л: гидролизат казеина 20,глюкоза 10, дрожжевбй экстракт 5,натрий хлористый 5, рН среды 7,2.Культивирование проводят при температуре 30 С с хорошей аэрацией допоздней логарифмической фазы роста.Выход влажных клеток составляет 2,43,0 г/л питательной среды,Выход фермента составляет 2000 ед.акт./г сырой биомассы, что более чемв 3 раза выше, чем известногоПолученная рестриктаза Бйа Б 1характеризуется следуккнми свойствами,"узнает и специфически расщепляет 45последовательность нуклеотидов ССАТС%/ 9 фоптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,2;оптимальная температура действия37 С;оптимальная концентрация ионовИаС 1 - 150 шИ, М 8 С 1 - 5-15 шИ.Фермент стабилен в течение не менее 6 мес,. при температуре -20 С, своо55боден от примесей неспецифическихэкэо- и эидонуклеаз, фосфатаз.Изобретение иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1. Клетки выращиваютв пробирке на скошенном питательномагаре с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта при температуре 30 Сов течение 16-18 ч, Этот объем инокулята равномерно вносят в 4 колбы собъемом 200 мл той же питательнойсреды, Культивирование в жидкой питательной среде проводят на термостатнрованной качалке. Полученную культуральнув жидкость центрифугируют при5 тыс.об/мин в течение 30 мин. Выходвлажных клеток составил 2,4-3,0 г/лпитательной среды,П р и м е р 2. 1 О г биомассыБгерососсив Гаеса 11 в 555 суспендируют в 30 мл 0,02 И трис-НС 1 буфера,рН 7,5, содержащего 1 10И/3-меркаптоэтанол и О, 1 Е тритон Х,иразрушают на ультразвуковои дезинтеграторе, Обломки клеток удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкостьнаносят на колонку с биогелем А 0,5 ш(В 1 о-Еад) объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 И калийфосфатным буфером,содержащии 1 ф 10И-меркаптоэтанол,5 10 И ЭДТА, 0,8 И ИаС 1 и 0,17. тритон Х (буфер А), Фермент элюируюттем же буфером со скоростью 20 мл/ч.Фракции объемом 10 мл собирают н анализируют на активность Фермента, Диализ фермента проводят против 2 л0,02 И калийфосфатного буфера, рН 7,5содержащего 1 10И /3-меркаптоэтанолаи 5 10 фЭДТА (буфер В), иеняя буФердважлы. Диализат наносят на колонкуобъемом 30 мл с бензнл-ДЕАЕ целлюлозой ("5.вша", С 13 А), уравновешеннуюбуфером В, Колонку промывают буферомВ, адсорбированный фермент элюируют300 мл градиента НаС 1 (0,0-1,0 М) вбуфере В, Фракции, элюируемые при0,45-0,55 И НаС 1, содержацие рестрик"тазу, объединяют и диализуют против2 л буфера В, меняя его дважды. Фермент после днализа наносят на колонку с сюсфоцеллкдозой (РЯьайшап)объемом 10 мл, уравновешенную буферои В, и промывают колонку тем жебуфером. Элюцию Фермента проводят200 мл градиента ИаС 1 (0,0-1,0 М)в буфере В, Фракции, содержащие рестриктазу,элюируемые при 0,43-0,55 МйаС 1, объединяют н диализуют против2 л буфера В. Затем проводят рехроматографию Фермента на Фосфоцеллюлозе Робъеиом 2 мл для концентрирования Фермента. Элюцию проводят 40 мл1645293 Составитель И. ПриваловаРедактор А. Маковская Техред М,Дндык Корректор М. Шароши Заказ 1322 Тираж 383 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета ло изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Нроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 градиента ИаС 1 (0,0-1,0 Г 1). Фракцииэлюируемые при 0,5-0,55 М Г 1 аС 1, объединяют и диалиэуют против буфера В,содержащего 0,1 М Г 1 аС 1 и 50 Х-ныйглицерин,Ферментный препарат хранится при-20 С. Выход фермента 2000 ед,акт./гбиомассы, активность 20000 ед./мл.За единицу активности принимаютминимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления1 мкг ДПЕ фага ф С 1 857 в течениечаса при температуре 37 ОС. Полученный штамм обладает следуюциии преимуществами по сравнению сизвестным:5- обеспечивает повышенный выходрестриктазы ЯЕа й 1;- растет на более доступных дешевых питательных средах отечественногопроизводства.1 ОФормула изобретенияЦтаим бактерий 81 герСососсцвЕаеса 1.в ВКПИ В- продуцентрестриктазы ЯГа Г 1 1.