Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
СПИИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 11 11 540873 Сова Советских Социалистических Республикгрисоединенцем заяв Государственный комитет Совета Министров СССР 23) Приорит(088.8) Опубликовано 30.1 76. Бюллетень Уо делам изобретенн и открытийпубликования описаци 08.02.7 АвторыизобретенияЗаявитель Б. М. Куриненко и Н. В. Калачева Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПАН КРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫя модифицированной панклеазы с повышенной синю (т. е. увеличенным отидролиз) по предлагаеодификации рибонуклеазы 1 етод ковалентного связыИзобретение относится к области биохимии ферментов и касается способа получения модифицированного (иммобилизованного) фермента панкреатической рибонуклеазы.Для модификации панкреатической рибонуклеазы известны многочисленные приемы ковалентного связывания ее с различными полимерными матрицами 11. Для методов ковалентного связывания используют целый ряд активированных носителей. Среди них известна активация полимерной матрицы обработкой раствором хлористого И-(,и-цитробензилоксиметил) -пиридиния с прогреванием прп 125 С 2.Однако в настоящее время отсутствуют данные о соотношении синтетазной и гидролазной активности для модифицированных форм фермента и влияния характера связывания фермента с полимерной матрицей на его синтетазную активность в реакциях синтеза олигонуклеотидов. Для нативных форм рибонуклеазы отношение синтез/гидролиз в реакциях полимеризации составляет, как правило, около единицы.С целью полученикреатической рибонугетазной активностьношением синтез/гмому способу для миспользуют новый х вация ее с активированнымц матрицами через .и-аминобензилоксцметпльный радикал.Отличительной особенностью предлагаемогоспособа является то, что панкрсатическую рп бонуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонерастворцмой матрицей - ХН,-целлюлозой пли с актцвцрованной водо- растворимой матрццей - ХН -полцглюкином при температуре от ОоС до 20 С. Матрицу ак тивируют обработкой раствором хлористого.-(,и-шпробепзцлокспмстцл) -ппрпдшгия по известному способу.У иммобцлцзованцых препаратов рибонуклеазы определяют синтетазную активность.15 Модификация рибонуклеазы состоит издвух стадий: активации матрицы ц связывания фермента.Пример 1.А. Активация водоцерастворцмой матрицы.21 1 г целлюлозы смешивают с 200 мг хлористого 1 ч- (,и-нитробензцлоксцметцл) -пцридцнця, растворенного в 2 мл 0,7%-ного раствора СН,СООХа, высушивают в зкспкаторе и прогревают 40 мцн при 125 С, Промывают водой, 25 бензолом и восстанавливают гидросльфитомнатрия (30 мнн при 50 - 60 С). Вновь промывают водой, 30%-ной уксусной кислотой и снова водой.300 мг амцноцеллюлозы охлаккдают в 3 мл 30 5%-ной НС 1, прц перемешцвапцц добавляютПродуктыреакции 20 С 0 - 2 С через час через час 1323 1323 323 13,3 82,3 4,4 13,6 60,4 26,0 С)р С (цитидийфосфат)Продуктыреакции при 20 С, через час при 0 - 2 С через, час 1323 323 1323 9,635,2 2,2 2,697,4 0 28,1558,313,5 2,197,90 5,093,8 1,2 29,4 24,5 56,1 1,897,0 1,2 16,2 54,0 31,8 13,6 60,4 26,0 С)рСр 3 мл 4 о/о-ного Ка 110, в 5%-ной НС 1, быстро промывают холодной водой.Б. Связывание фермента с водонерастворимой матрицей.1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы в трис-НС 1 буфере (О 02 М, рН 7 3;20 мг/мл) добавляют и диазотированной целлюлозе, перемешивают и добавляют 2 мл 0,2 М трис-НС 1-буфера (рН 8,5). Смесь перемешивают 3 час и оставляют на ночь. Связывание проводят при 20"С. Аналогичным образом проводят связывание при 0"С. Связанные препараты отмывают от несвязанных холодной водой.Количество связанной рибонуклеазы по отношению к рибонуклеазе, взятой в реакцию, составляет для целлюлозы 40 - 50%.Пример 2.А, Активация водорастворимой матрицы.1 г полиглюкина смешивают с 200 мг хлористого Х- (,и-нитробензилоксиметил) -пиридиния, растворенного в 2 мл 0,7/о-ного раствора С 1-1 зСООВ 1 а, высушивают в эксикаторе и прогревают 30 мин при 1 ОО - 110"С. Растворяют в воде и осаждают спиртом. Затем восстанавливают гидросульфитом натрия (30 мин при 50 - 60 С). Йиализуют против воды, осаждают спиртом и высушивают эфиром.300 мг аминополиглюкина растворяют в 3 мл 5/о-ной НС 1, охлаждают и добавляют при перемешивании 3 мл 4%-ного КаХО, в 5 "/о-ной НС 1, Через 1 мин осаждают двойным объемом холодного спирта, Осадок снова обрабатывают спиртом, дважды эфиром, быстро высушивают и растворяют в 2 мл холодной воды.Б. Связывание фермента с водорастворимой матрицей.1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы в трис-НС 1-буфере (0,02 М рН 7,3,5 10 15 20 25 30 35 40 20 мг/мл) добавляют к 2 мл диазотированногопол иглюкина, перемешивают и добавляют2 мл 0,2 М трис-НС 1-буфера (рН 8,5).Смесь оставляют на ночь,Связывание проводят при 20 С.2,5 мл рибонуклеазы, связанной с аминополиглюкином, помещают на колонку с сефадексом У. = 100 и элюируют 0,02 М трис-НС 1-буфером (рН 7,8) с 0,14 М ХаС 1,Аналогичным образом проводят связывание при 0 С.Количество связанной рибонуклеазы составляет 20 - 25% по отношению к рибонуклеазе,взятой в реакцию.У полученных связанных препаратов определяют содержание белка биуретовым методом.Очищенные препараты анализируют на синтетазную активность.Ниже приводится пример, иллюстрирующийповышение синтетазной активности.Синтез днцнтидинмонофосфата (СрС). Готовят реакционную смесь следующего состава:Пгнкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза)0,8 мг/мл 0,02 млЦитидинциклофосфат (С) р)(Ха-соль) 12,5 мкмоль 4,5 мгЦитидин (С) ,37,5 мкмоль 9,2 мгТрис-НС 1-буфер 0,06 М, рН 7,6 0,03 млСмесь инкубиру 1 от при 0 С. Через определенные промежутки времени (1 час, 3 час,23 час) из реакционной смеси отбирают пробы по 0,003 мл, которые анализируют при помощи электрофореза на бумаге в триэтиламмонийбикарбонатном буфере (0,05 М, рН 7,5,/= 0,5 гпа/см, Р = 1000 в) . Индианка цию пятеносуществляют по гашению флуоресценции вУФ-свете. Вещество с бумаги элюнруют 0,1 н.НС 1. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при Х 280 нм,540873 Таблица 3 Отно:пение СрС/Ср, % через промежутки времени, час РНК-аза 23 0,5 РНК-аза панкреати- ческая 0,5 0,34 РНК-аза - 11 Н,-полиглюкин при 20 С РНК-аза - 1 ЧН,-полиглюкин при 0 - 2 С РНК-аза - КН,-целлюлоза при 20"С РНК-аза - МН,-целлюлоза при 0 - 2 С 3,0 6,1 2,42 0,5 2,8 0,9 1,5 4,1 2,1 2,1 2,6 4,2 Составитель С. Чернова Техред А. Камышникова Редактор Г, Никольская Корректор Л. Брахнина Заказ 3010/5 Изд.1914 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комцтета Совета Министров СССР по делам изобретенцй и открытии 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 45Типография, пр., Сапунова 2 Выход продуктов реакции синтеза (%) несвязанной рибонуклеазы и связанной с КНзполиглюкином представлены в табл. 1,Выход продуктов реакции синтеза несвязанной рибонуклеазы и связанной с ХН 2-целлюлозой представлен в табл. 2.Формула изобретенияСпособ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы, включающий активацию матрицы хлористым К-(м-нитробензилокоиметил)-пиридинием при нагревании, 10 отличающийся тем, что, с целью повышения синтетазной активности, панкреатичеокую рибонуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонер астворимой матрицей МН,-целлюлозой или с активированной водо растворимой матрицей - ХН-полиглюкиномпри температуре 0 - 20"С.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Кестнер А. И., Успехи химии, 63, 1480 2,1 (1974), вып, 8.2, Курсанов Д. П. и Солоднов П. А. ж.прикл. химии, 16, 351, 1943.
СмотретьЗаявка
2087851, 23.12.1974
КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА
КУРИНЕНКО БОРИС МИХАЙЛОВИЧ, КАЛАЧЕВА НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА
МПК / Метки
МПК: C07G 7/00
Метки: модифицированной, панкреатической, рибонуклеазы
Опубликовано: 30.12.1976
Код ссылки
<a href="https://patents.su/3-540873-sposob-polucheniya-modificirovannojj-pankreaticheskojj-ribonukleazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы</a>
Предыдущий патент: М-фенилен-бисо-органодиэтиламидотиофосфаты как противостарители эластомеров
Следующий патент: Способ получения дезоксирибонуклеозидов
Случайный патент: Пирометр