Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты

ОПИСИЗОБРЕТЕНИЯ ф"кеи 4%кЬть,а В) р щ 652187 Ссноз Соеетсннк Сецнавнстнчесннк Республнк(23) Приорите Государ Опубликовано 150379 Бюллетень % едаи) Авторы изобретения Г.Д.Бердыше Д.Бабенюк и Н.А,Луцен вский ордена Ленина Государственный универстит им. Т.Г.Шевченко(71) Заявитель 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛО я к усоверполучениякислоты иэв - гонад рыбмьпаленного Иэобретшенствовандеэоксириббиологичесдобываемыхлова. ние относит ому способу нуклеиновой их источник во время пр новыеных целянкциипримегенногопарат лотыпреые овые киачествек лечеболеэни,ерозе иения иуклеози о и.,теза репараты ых кисло чают тол ского сы тивный вых кисл ел еще 30 В настоящее время нукле кислоты используются в нау для изучения структуры и ф нуклеиновых кислот, а такж няются для изучения их мут действия на генетический а клетки. Кроме того, нуклеин широко применяются в к паратов в медицине. ка средства при лучевой б заболеваниях, атероскл используются для получ азотистых оснований, н нуклеотидов. Следует отметить, что и высокополимерных нуклеинов до настоящего времени полу ко из. природного биологиче рья. Химический и фермента синтез полимерных. нуклеино только изучается и не наш широкого применения, бликования описания 150379 Сырьем для выделения нуклеиновыхкислот в лабораторных условиях являются всевозможные органы и тканикак животных, так и растительныхорганизмов, в том числе и микроорганизмов. Однако содержание нуклеиновых кислот в них неодинакова.Поскольку выделение нуклеиновыхкислот весьма сложный, трудоемкийи дорогостоящий процесс, для промыв:ленных целей необходимы источники сырья, характеризующиеся большим содержанием нуклеиновых кислот.В настоящее время для промыаленного получения препаратов в деэоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) используют, в оснОвном, зрелые молокирыб, поскольку они содержат наибольшее количество ДНК по сравнению сдругими источниками. Например,высушенные молоки лососевых Рыб содержат 49 ДНК,Молоки различных видов пресноводных и морских рыб являются наиболееудобным и подходящим сырьем дЛЯ промышленного получения ДНК еще и потому, что.они содержат весьма незначительное количество рибонуклеиновыхкислот (РНК) и других примесей.3,Для получения больших количествДНК обычно заготавливают молокивысокополовозрелых рыб, добываемыхна рцборазвбдных заводах, на местахнерестилнц; или специально снаряженной научной заготовительной экспедицией. Собранные молоки или немедленно используют для выделения из нихпрепаратов ДНК или подвергают глубокому замораживанию в специальныххолодильниках до -20, -70 С с последуюцим хранением в диапазоне тем- Юператур от 0 до -25 фС. Недостаточноглубокое охлаждение может привестик повреждению ДНК имеюцимися в молоках Ферментами-нуклеазами.Согласно известному способу дез 15оксирибонуклеиновую кислоту получаютиз спермы рыб путем ее гомогенизации,солевой экстракции деэоксирибонуклеопротеида, диссоциации его на ДНК ибелок и поСледуюцей детергентнойдепротеиизации. Например, берутсвежие зрелые молоки сельди 170 смизвлекают ядра сперматозоидов путем, плаэмодиза спермы ледяной дистиллированной водой в течение 20 мнн. За- фтемсуспензию ядерцентрифугируют втечение 15 мин при 3000 об/мйи иахолоду. Образовавшийсярыхлййбелыйосадок суспензируют в 500 мл водыи центрифуГируют прй 3000 об/мий. ЗООсадок ядер суспеиэируют в 0,005-ном растворе лймонной кислоты, снова центрифугируют. Осадок, прожтыйдва разаводой, высушивают" смесьюспирта и эфира. Полученный осадокядер суспензируют в 150 см воды и го-могенизируют в 250 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, после чеговязкуюмассу разбавляют в.1100 мяраствора ИаСВ . После 12-часового,охлаждения вязкую массу ДНК смешивают с 9 объемами воды. Образовавшийся осадок Днк в виде длйнйых нитейнесколько раз промывают водой, спиртом и высушивают спирт-эфиром. Послеэтого иэ );НП выделяют ДНК. Для этого.берут 40 мл деэоксирибонуклеопротамина в 10-ном растворе МаС 4, перенасыцают .хлористым натрием и оставляют,на ЪО дней в холодильнике дЛя отделе-,ния белка от ДНК. Затем смесь центри Фугируют; осадок. белков отделяют, - аполученный супернатаит (для дальнейшей очистки от белков) пропускаютчврез слой йорошкообразной целюполозы (или через бумажный Фильтр), 55Нуклеиновые кислоты осаждают несколькими объемами 96-ного спирта. ДНКвысушивают в спирт-эфире и над Р Опри 100 С в вакууме (1).Целью изобретения является упрощение способа получения целевогопродукта и расширение сырьевсй базы.Поставленная цель достигается темчтов качестве сырья используют гонады111-У стадий половой зрелости рыб,консервированные в концентрированном этиловом спирте без использования минусовых температур.Описывается способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что гонады 111-У стадий половой зрелости рыб, консервированные в концентрированном этило" вом спирте, гомогеннзируют, гомогенизированную ткань обрабатывают протеолитическим Ферментом, обычно трнпсином или проназой, осуществляют солевую экстракцию дезоксирибонуклеопротеида, диссоциацию его на ДНК и белок и последуюцую детергентную депротенизацию. Целевой продукт выделяют известными приемами.П р и м е р . Берут 200 г консервированных в этаноле гонад"рыб(Ш-У стадий половой зрелости), измельчают на гомогенизаторе в 1 л 0,15 М раствора хлористого натрия, содержащего 0,05 М раствора цитрата натрия и центрифугируют. Этот процесс промывки ведут до техпор; пока надосадочный раствор не Дает осадок при добавлении к нему 5% трихлоруксусной кислоты (3-4 раза), После этого осадок сусйензирувт в 400 мл раствора протеолитического фермента, например трййсина или проназы (50 микрограмм в мп,"20 мг в 400 мл)инкубируют втечение 18 чпри 37 фС. Лизированные клетки обрабатывают 0,5 Ъ додецилсульфата натрия (который инактивиРует протеолитический фермент и денатуриРуетбелки ДИП, частично его депротеинизируя), Вязкую массу, содержащую ДЯП, суспензируют в 12 л раствора, содержацего 16,16 г хлористого натрия (0,15 М) и 71,4 г цитрата натрия (0,05 М), далее добавляют 1 л раствора, содержащего 6,8 г хлористого натрия, 35,5 г цитрата Натрий и 180 г парааминосалициловой кислоты (ПАСКа), перемешйвают и к полученной смеси приливают 3 л водонасыценного фенола, рн 8,3 (1,98 л свежеперегнанного фенола 0,79 л дистиллированной воды,.198 мл 1 н КОН).После встряхивания в течение 1 ч сМесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. К надосадочной жидкости добавляот сухой хлористый натрий до конечной концентрации 3 М (173 г на 1 л раствора),перемешивают до растворения соли н приливают равный объем смеси хлороформизоамнловый спирт (24:1), встряхивают в течение 45 мин и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость (раствор ДНК) вливают в равнь 1 й объем концентрированного этанола. Нити ДЯК выпадают в осадоких собирают., центрнфугированием, промы-. вают последовательно следующими.растворами: 3 М раствор хлористого натрия + этанол (2:1), этанол + эфир (3:1) н эфир. Нити ДнК подсушивают652187 Формула изобретения Составитель Г,Коннова Редактор Л.Новожилова Техред М.Петко Корректор И.КовальчукТираж 512 .Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1-13035, Москва, Ж, Рауыская йаб., д.4/5щ еашшшю ш шее шЗаказ 979/25 Филиал ППП Патентф, г.ужгород, улЛроектная,4 в течение 3-4 ч в термостате при37 С,а затем в вакууме-эксикаторе.с СаСРе.Для получения целевого продукта(ДНК) повышенной частоты ДНК, полученную из гонад, обрабатывают ферментом РНК"азой (15 мкг/мл), предварительно. прокипяченным для разрушения примесей ДНК-азы, а затемпротеолитическим ферментом трипсином (100 мкг на 1 л раствора) . РНКаза удаляет примесь РНК в препара" Ютах ДНК, а трипсин перевариваетРНК-азу и оставшиеся в ДНК примесибелков.От продуктов ферментативного гидролиза РНК освобождают двухкратным 15переосаждением в изопропиловом спирте. После такой обработки ДНК несколько раз перерастворяют в стандартномсолевом растворе (0,15 М ЫаСВ++ 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0),проводят еще одну-две депротеинизации с хлороформом, после чего осаждают добавлением двух объемов концентрированного этанола, промывают нес-колько раз 70-ным этанолом, эфироми сохраняют в 70-ном этаноле при О- ф3 С или в высушенном виде в вакуумномэксикаторе над СаСЦ, или в стайдарт-зном солевом растворе в зависимостиот дальнейшего исйользования.Нище йриведеиы данные О Свойствах З)и характеристиках .препаратов ДНК,полученных ойисанным методом из консервированных в этаноле гонад рыб,например горбуши, хранящихся в 96 ном этаноле в течение 1 ч. 35Молекулярный вес,млн,дальтонов 8-10Гиперхромиыйэффект, 37-40Содержание белка, Около 1Примеси полисахаридов Нет Примеси РНК НетПримеси денатурированной ДНК НетПример деградированныхпродуктов ДНК, РНК . НетЕеееЕем 2,8ф ф1,921,3е/р/ 6600Фосфор 1,7Температура плавления фС 86,8Содержание фенола НетАналогична характеристика препаратов ДНК, полученных из гонад карпа, камбалы и некоторых других рыб, законсервированных в этаноле. 1. Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из спермы рыб путем ее гомогенизации, солевой экстракции дезоксирибонуклеопротеида, диссоциаций его иа ДНК и белок и по "- следующей детергентной депротенмзации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью унрощ ения процесса н расширения сырьевой базы, в качестве сырья используют гонады Ю-у стайий половой зрелости рыб, консерзироеаиные в концентрированном этиловом спкрте, а гомогенизированную ткань обрабатывают прОтеолитическим ферментом.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю," щ и й с я тем, что в качестве протеолитических Ферментов используют трипсин или проказу.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1,Рейх КЯЙег ЙКеейеЬ АйоЫ(. ц Йцс 3 еаРРОГ 001 п", НОрре ЗеЕЬРЬзйсЬф. РЫ 3 ЕОЙ. СИФФЕВ., 1951, В 289, 224-234,