Способ получения дезоксирибонуклеозидов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ц 1) 54 О 874 Сс газ Советски х Соцналнстичсских Реса:.;ик(22) Заявлено 03.03.75 (21) 211017804 151) М. Кл.- "С 07 Н 19,00 с присоединением заявки М -Гасударственный комитет (23) ПриоритетСовета Министров СССРОпубликовано 301276 )бюллетень ха 4(088,8) и открытий Дата опублцкогашя оп.сания 08.02.77(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕ О то в ка- дерива- шленного Изобретение относится к области получения веществ, которые находят широкое применение в медицине) а также в химической промышленности как полупродукт для синтеза реактивов и лечебных препаратов,Известен способ получения дезоксирибонуклеозидов путем выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с последующим гидролизом ее неочищенным ферментным препаратом, выделенным из почек лососевых рыб и обработанным протамином, при 37 С.Образующуюся после гидролиза смесь очищают путем многократной фильтрации, центрифугирования, экстракции, упаривания и разделяют методом ионообменной хроматографии 1.Недостатками известного способа являются: сложность выделения целевого продукта, дороговизна его получения, обусловленная необходимостью предварительно выделять и охарактеризовывать ДНК, а также снижение выхода целевого продукта из-за присутствия в ферментном препарате дезаминаз, разрушаюцих дезоксирибонуклеозиды,Целью изобретения является упрощение процесса и удешевление себестоимости получения целевого продукта,Указанная цель дсстигается тем, ччестве исходного сырья, содержащеготы Д 1-1 К, используют отходы цромы производства протамшсульфата цз молок лососевых рыб, которые гидролизуют при 36 - 38 С очищенным от дезаминаз ферментным препаратом нуклеаз. Образующиеся при этом 5 дезоксирибонуклеозиды ц дезоксцрпбонуклеотиды из раствора извлекают кислотной экстракцией с последующим повторным пдролизом кишечной фосфатазой, Смесь дезоксирибонуклеозидов разделяют методом ионнооб менной хроматографии. Для кислотной экстракции обычно используют 7 с/с-ную трихлоруксусную кислоту.Используемый фермевный препарат, полученный из почек лососевых рыб, свободен от 15 примесей дезаминаз и представляет собойсмесь фракций дезоксирибонуклеаз ц фосфатаз, объединенных в один ферментный препарат, называемый нуклеазой.Сущность метода получения нуклеаз из по;) чек лососевых рыб состоит в кислотной экстракции белков, обладающих ферментной активностью, которые затем фракционпруют сернокислым аммонпем, разделяют на сефалексе Гс последующим выделением фрак ций дезоксирибонуклеаз и фосфатаз, например методом цоцообмецной хроматографии на колонке с ДЕЛЕ-целлюлозой.П р и м е р 1. 100 г отходов производствапротампнсульфата цз молок рыб гомогецизцЗз руют в 1,8 л 0,02 М раствора Мо 504 7 Н.О,540874 Т аблица 1 Дезоксирибонуклеозиды, выделенные из отходов производства протамин:ульфата из молок лососевыхпород рыб Количественный выход де- зоксирибонуклеозсдон, от веса сухихотходов Коли чественньси выход дезоксирибонуклеозидсов, мг на 100 г сухихотколов 0,50,40,450,5 0,00050,00040,003450,0005 Ы-Цитидин с 1- Аденоз ин с 1-Гуанозин Тимидин Т аблица 2 Количественный выход де- зоксирибонуклеозидов, мг на 100 г сухихотходов Количественный выход дезоксирибонуклеозидов,от веса сухихотходов 55 Дезоксирибонуклеозиды 60с 1-Цитидинс 1-Аленин 0,0002 0,0001 0,0002 0,0008 0,2 0,1 0,2 0,3 Ы-ГуанззинТимилин доводят рН гомогената до 7,6 1 н. раствором КОН и добавляют 50 мг ферментного препарата нуклеаз, Общий объем реакционной смеси доводят до 2 л 0,02 М раствором МфО 4 7 НО и инкубируют при 37 С в течение 20 час.По окончании ферментгтивного гпдролиза инкубационную смесь центрифугнруют в течение 40 мин при 5000 д. Из осадка после центрифугирования экстрагируют в течение 1 час при встряхивании кислоторастворимые компоненты дезоксирибонуклеиновой кислоты 400 мл 7%-ной трпхлоруксусной кислоты, приготовленной ил основе 0,02 Мраствора М 801 7 Н,О, гидролизат и кислотный экстракт объединяют раствором Н 4 ОН, рН полученной смеси догодят до 7,0 и вносят 150 мг фсрментного 1 репарата кишечной фосфатазы.Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37 С в течение 24 час.Из упаренного до объема 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центрифугированием за 20 мин прн 4500 д, экстрагиру 1 от дезоксирибонуклеозиды 96%- ным этанолом (из расчета на одич обьем раствора - четыре объема 96%-ного гидролизного спирта). Спиртовой экстракт дезоксирпбонуклеозидов упарисзают при 25 С до сиропообразного состояния, затем растворяют в воде, доводят общий объем до 200 мл и смешивают с 85 г активированного угля.Дезоксирибонуклеозиды элюируют с активированного угля на воронке Б 1 охнера 8 л 50%-ного этанола, содер(ащего 1% аммиака, Элюат упаризают, дсзодят рН до 10,5 28%- ным раствором МН 4 ОН и фильтруют полученный раствор через фильтровальну 1 о бсумагу ,ватман Х 1). Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов осуществляют ионообменной хроматографией на смоле Дауэкс 2(8. Элюируют дезоксирибонуклеозиды 12 л 0,4 М раствора формиата аммония (рН 9,6), смешанного с 12 л воды (р 1-1 9 - 1 чН 4 ОН). В фракциях эсноата количество дезоксирибонуклеозидов определяют по УФ-поглосцению при 260 нм и при помощи цистеинсерной кислоты, Фракции, содержащие дезоксирибонуклеозиды, упаривают до небольшого объема; дезоксирибонуклеозиды выкристаллизовывают при 0 С,Выход дезоксирибонуклеозидов пз отходовпроизводства протамипсульфата из молок рыбприведен з табл, 1,П р и х 1 с р 2, ПОЛ 1 чение дезоксприбонукле 5 озпдов кислотной экстракц 11 ей.100 г Отходов производства протаминсульфята пз .10 л 01 с рыб тсцятелы 10 измельчяют, из:1 ельченную массу помещают в 850 мл 7%-нойтрихлору 1 ссусной кисло, пр 14 готовленпоЙ наГО основе 0,02 М раствора Мд 804 71.1.0, щс; л 1.- 11 о перемешивают в теченис 1 час и цент.ифугиру 1 от 40 мин при ОООО д, Осадок отс 1 расыа 1 от, а рН супернатанта доводят до 7,0 раствором Х 114 ОЙ и вносят 150 х:г фсрментного15 препарата кишечной фо:фатазы. Полученнуюреакцисснную смесь гидролпзуют 1 ри 37 С вте:1 ение 24 час.Из упаренного до 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центри 21 фугировапием в тсчение 20 мин при 4500 д,дезоксирибонуклеозиды экстрагируют 96%пым этанолом (из расчета на один объем полученного раствора - четыре объема 96% -ного гидролизного спирта).25 Спиртовой экстракт дезоксирибонуклеозидов упаривают при 25 С до сиропообразногоссстояния, затем растзоряют в воде, доводятс.бщий объем раствора до 200 мл и смешиваютс 85 г активированного угля.31 Дезоксирибонуклеозиды элсоируют с активированного угля на воронке 1 эюхнера 8 л 50%ного этаноля, содержащего 1% аммиака,Элюат упарпвают, рН остатка доводят до10,5 28%-ным раствором ХН 4 ОН и фильтруют35 расзвс)р через фпльтровальную бумагу (ватк 1 ан к 1 о 1)Разделение смеси дезсксирибонуклеозидовОсуществляют методом по:1 ообменной хрома,ограф 11 п на смоле Дауэкс 2 Р,8. Элюируют41 дезоксприбопуклеозпды 12 л 0,4 М формиатааммония (рН 8,6), смешанного с 12 л воды(рН 9, .чН 4011). В собранных фракциях элюаа количество дезоксирибонуклеозидов определяют спектрофотометрически и при помощи45 цпсте 11 нсернОЙ аслот, Фракции, содержашиедезсксирибонуклеозиды, упарнвают до небольшого объема, дезоксприбонуклеозиды выкристаллизовывают при 0 С.Выход дезоксирпбону 41 слеозидов из отходов50 производства гротаминсульфата из молок540874 Формула изобретения Таблица 3 Количеств"нный выход де- зоксирибснуклеозидов, г в пересчете на 10 кг отколов Количественный выход дезокснрпбонуклеозидов, о от веса сухихотходов Дезоксирибону- клеозиды Н-Цитплин 1-Аленозин 46,2 39,5 49,1 0,03046 0,00039 0,00043 0,00049 1-ГуанэзинТимилин Составитель С, черноваТехред А. Камыш ни кова Редактор И. Астафьева Корректор Л. Брахннна Заказ 3010/6 Изл. М 1914 Тираж 575 Полппсное ЦИИИПИ Государственного комитета Совета М 1 ишстров СССР по делам изобретений н открытий 113035, Моеква"гК, Рауп 1 нан наб., д. 4,5Типографии, пр., Сап 1 нова 2 рыб, полученных путем непосредственной кислотной экстракции, приведен в табл. 2.П р и м е р 3. 500 г отходов производства протаминсульфата из молок рыб тщательно измельчают, помещают в 8,6 л 0,02 М раствора Мд 504 7 Н 20, доводят рН до,6 1 н. раствором КОН, после чего к полученной смеси добавляют 250 мг ферментного препарата нуклеаз и доводят общий ооъем раствора до 9 л 0,02 М раствором Мд 504 НзО. Реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 20 час.По окончании ферментативного гидролиза инкубационную смесь центрифугируют 40 мин при 5000 д, из осадка дополнительно экстрагируют в течение 1 час при встряхивании кислоторастворимые компоненты ДНК 2 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты, приготовленной на основе 0,002 М раствора Мд 04 7 Н 20, гидролизат и кислотный экстракт объединяют, доводят рН до 7,0 раствором МНОН и вносят 750 мг ферментного препарата кишечной фосфатазы. Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37 С в течение 24 час.Из упаренного до объема 250 мл раствора дезоксирибонуклеотиды экстрагиру 1 от 96%- ным этанолом. Спиртовой экстракт упаривают при 25 С до сирспсобразного состояния, растворяют в воде, доводят общий объем до 600 мл и смешивают с 250 г активировагп ого угля.Дезоксирибонуклеозиды элюируют с активированного угля на воронке Бюхнера 30 л 50%-ного этанола, содержащего 1% аммиака,6Элюат упаривают, рН остатка доводят до10,5 28%-ным раствором ХН 40 Н и фильтруют через фильтровальную бумагу.Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов 5 осуществляют методом ионообменной хроматографии на смоле Дауэкс 2 К 8. Дезоксири бонуклеозпды элюируют 35 л 0,4 М формиата аммония (рН 8,6), смешанного с 35 л воды (рН 9, ХИ.ОН). В сосранных фракциях элю ата определяют количество дезоксирибонуклеозидов при помощи цистеинсерной кислоты и спектрофотометрически. Фракции, содержащие дезоксирибонуклеознды, упаривают до небольшого объема; дезоксирибонуклеозиды вы кристаллизозывают при 0 С.Выход дезоксирпбонуклеозидов приведен втабл. 3. 1. Способ получения дезоксирибонуклеозидов путем гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот (ь 1 К) прп температуре 36 - 38 С фер ментпь;м препаратом, выделенным из почеклососевых рыо, с использованием разделения образующейся смеси дезоксирибонуклеозидов методом ионосбменной хроматографии, отл и- чающий с я тем, ч го, с целью упрощения 31 процесса и удешевления себестоимости получения целевого продукта, в качестве исходного сырья, содержащего дериваты ДНК, используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, которые гидролизуют очищен ным от дезаминаз ферментным препаратомпуклеаз, после чего образующиеся дезоксирибонуклесзиды и дезоксирибонуклеотиды из раствора извлекают кислотной экстракцией с последующим попзторным гидролизом кишеч.40 ной фосфатазой.2, Способ по п. 1, о тли ч а югций ся тем,что для кислотной экстр акции используют 7%-ную трпхлоруксусную кислоту.Источники информации, принятые во внима нпе прп экспертизе изобретения:1, ЛЬс 1 п:11 ацапп апс 1 Н,Л.А. Таг.,)оцгпа 1о 1 Г 1611 ег 1 ев ге.сагс 11 Ьоагд о 1 Сапаг)а, 196118 о 3, 349 - 366.