Способ получения иммобилизованных ферментов

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскык Социалистических Республик(22) Заявлено 21,08.74 (21) 2058144/23-04 Л 1. Кл.е С 07 С 1 7/О Приоритет - ( 2.08.7 Государствекиый комете Совета Мкнкстрав СССР по делам кзоаретеввд к открытей(72) Автори изобретения ностранцыюран и Пьер Монса (Франция) г(71) Заявит 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТО еакццонцосцособ дается реа молекул водл носителя по приводи фермента, а следова таточно стабильных к пивцы л Изобретение относится к способу получения яммобнлизованцых ферментов. Комплексы носитель. фермент могут находить применение в качестве специфических катализаторов в химической, пишевой и фармацевтической промышленности.Известно, что использование ферментов в малотоннажной промышленности ограничено их нестабильностью, При более рациональном использова. нии ферментов их фиксируют на нерастворимых носителях при помо.ци адсорбции или введением в нерастворимые гели, или путем образования ковалентной связи между носителем и ферментом.В литературе описаны многочисленные способы получения иммобилизованных ферментов. Наиболее часто используется метод фиксации ферментов на носителях посредством образования между ними ковалентной связи, Он осушествляется путем кон. тактирования фермента с активированным носите. лем в среде полностью или частично водной. Прн этом поддерживают рН, при котором фермент стабилен, и температуру ниже 50 С.Однако скорость процесса фиксации является медленной, а получаемые комплексы носитель. фермент часто недостаточно стабильны или мало- активны 11. Кроме того, в этом процессе наблюными группамиченной фиксациител ьцо кполучению недос и апрепаратов,С целью повышения стабильности фермента,связанного с носителем, в предложенном способепроцесс ведут в среде безводного апротоццогорастворителя при 30 - 120 С, что позволяе полу.чать комплекс носитель фермент с повьцпспцымколичеством фиксцрованного фермента,В литературе отсутствуют сведения о способеполучения иммобилизовацных ферментов, которыйосуществлялся бы в безводной органической среде.В качестве апротоццых органических раствори.телей используют алифатическне, циклоалцфати.ческне и ароматические углеводороды.В качестве носителя используют минеральные,органические или органоминеральцые соелицецця,не растворимые в органической среде и облацаюпгиеодной или несколькими реакционцоспособцылтифункциональными группами, такими как амин,карбоксил, сульфогидрил. гидроксил. В слу це,когда носитель не обладает сам по себе указангц мигруппами, его модифицируют.1 О 75 35 40 55 60 В качестве цосителей применяют кирпич, окись кремния, окись алюминия, глину, лесок, агарозу, крахмал, полидскстрац, целлюлозу, полимеры, такие как полибутадиен, полистирол сетчатый или це сетчатый, сополимеры метакриловой кислоты, сополимеры малеинового ангидрида и этилена,Носитель модифицируют или активируют таким образом, чтобы снабдить его одной или несколькими функциональиыми группами, реагируюшими с ферментом. Модификацию осушествляют известными способами в зависимости от природы взятого носителя и фиксируемого фермента. Активацию ведут диаэотированием или галогенированием, или сульфировацием. Можно назвать реакции носителя, например, с галогенидами сульфурила, цианурила, дициана, тионила, прививочную сополимериэацию носителя, а именно полимеры с полифункциональными гидролиэую 1 цимися силацами или с карбонильными группами.Такие носители применяются в виде зерен,размер которых в большинстве случаев больший, чем 100 мкм, может сильно меняться. Они должны быть свободны от всех продуктов, ингибируюших или децатурируюших ферменты, и от всяких следов воды.В качестве органической среды, не растворяющей фермент, используют углеводороды алифатические, циклоалифатические, ароматические, например гексан, бензол, толуол, ксилол, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, трихлорэтан, трихлорэтилен, лерхлорэтилен, диоксан, тетрагидрофуран, диме тилсульфоксид. Углеводороды применяются индивидуально или в смеси.Процесс проводят следующим образом.Активньй носитель и один или несколько ферментов диспергируют одновременно или последова. тельно в углеводороде, затем реакционную смесь нагревают до температуры реакции, предпочтительно до температуры кипения, в течение времени, необходимого для фиксации фермента, Фермент берут в избытке по отношению к функциональным группам носителя. Количество используемого угле. водорода меняется в зависимости от природы носи. теля и фермента. Процесс ведут при 30 - 120 С, температура зависит от природы утлеводорода и фермента. Для ускорения реакции можно работать при повышенном давлении. В отличие ат известного метода рН среды в процессе фиксации не влияет на свойства фиксированного фермента. Время реакции составляет от нескольких минут до 2 ч. После фиксации углеводород легко отделяют и полученньщ комплекс носитель. фермент промывают буферным раствором, взятым с таким рН и такого состава, чтобы он не вызывал денатурацию комп. лекса. В результате фермент адсорбируется на носи. теле. Затем фермент можно испольэовать вновь в реакции фиксации.Полученные комплексы носитель-фермент со. стоят из одного или нескольких ферментов, фиксированных на носителе. В случае, когда комплекс содержит несколько фермецюв, последние могут фиксироваться либо одновременно, либо последо. вательцо. Хорошие комплексы получают смешивание м двух комплексов. Количество фермента, фиксированного при помощи ковалентных связей, зависит от природы фермента, а также от природы и структуры носителя.Предлагаемые комплексы носитель-фермент могут существовать при более высоких температурах, чем известные комплексы, полученные в вод. ной среде, Кроме того, их выгодно использовать непрерывно в течение довольно длительного времени, так как фермент не теряет своей активности. П р и м е р 1. Фиксация пектиназы на кирпиче. Растолченньй и просеянный однородньйкирпич с размером зерен 0,5 - 0,8 мм промывают дистиллированной вод й, затем водным раствором 1 и, соляной кислоты и опять дистиллированной водой. После прокаливания в течение 15 ч в атмо. сфере кислорода при 700 С получают активированный кирпич, не содержащий примесей, 2 г кирпича вносят в 40 мл 10 о ного по объему раствора хлористого сульфурила в безводном бенэоле. Затем суслензию перемешивают, доводят до температуры кипения и выдерживают при этой температуре 20 ч.Полученньй активньй кирпич отделяют. 0,5 г продажной пектиназы и затем 2 г активно. го кирпича диспергируют при помоши звука в 50 мл безводного бензола. Полученную дисперсию нагревают при температуре кипения 1 ч. После охлаждения твердое вещество отжимают, промывают 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, оставляя смесь стоять 15 ч при 4 С, центрифутируют и сушат, Промывание проводят 7 раз, что позволяет десорбировать адсорбированньй на носителе фермент, который можно использовать снова. После каждого промывания твердого вещества, состоящего из комплекса носитель-фермент, в котором фермент фиксирован на носителе при помощи ковалентной связи, определяют фермеитативную активность. Это делают следующим образом,1 г комплекса диспергируют в 10 мл 0,4 о-ного по весу раствора полигалактуроновой кислоты в ацетатном 0,01 М буферном растворе с рН 4. Дисперсию нагревают при 35 С 30 мин. После охлаждения и декантации отбирают 5 мл раствора, затем прибавляют 0,3 мл 9 ного по весу раствора сульфата цинка в воде и 0,3 мл 1 н. водного раствора соды н дают отстояться, После центрифутирова. ния определяют количество восстановленных соединений в оставшейся части при помощи динит. росалицилатного метода. Для сравнения каждый опыт повторяют, осуществляя фиксацию в водной среде. При этом берут раствор 0,5 мг пектиназы в 50 мл воды, 2 г активного кирпича и выдерживают при 4 С 7 ч. Полученные результаты приведены в табл. 1,где они выражаются в процентах активностикомплекса по отношению к активности фермента до фиксации.Как видно иэ табл, 1, фиксация фермента в бензоле является более быстрой, чем в водной среде. Кроме того, пектнназа, фиксированная в органическом растворителе, является более стабильной, чем пектиназа, фиксированная в водной среде. С другой стороны, для пектиназы, фиксированной в органической среде, сначала наблюдается некоторое понижение активности; затем активность остается постоянной после 3-го про;,ывания, в то время как активность пектиназы, фиксированной в водной среде, непрерывно уменьшается, Таким образом, количество фермента, ковалентно фиксированного в органической среде, определенновыше, чем количество, фиксированного в водной среде,П р и м е р 2. Фиксация папаина на кирпиче.2 мг папаина и 2 г активного кирпича,аналогичного примеру 1, суспендируют в 20 мл гексана. Полученную суспензию нагревают с обратным холодильником 1 ч, После охлаждения отделяют твердое вещество, промывают водой, 20 мл 1 М раствора хлористого натрия и еще раз водой. Затем. измеряют ферментативную активность полученного комплекса носитель-фермент, суспендируя последний в 1 мл воды, прибавляют 9 мл 0,3 о-ного по весу раствора казеина в фосфат-цитратном 0,025 М буферном растворе с рН 7. Суспензию нагревают при 37 С 10 мин. После охлаждения и декантации отбирают 4 мл раствора и прибавляют 4 мл 10 о ного по весу водного раствора трихлоруксусной кислоты. Иэбьпок казеина уходит в осадок, его отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание пептидов по методу Лоури, Комплекс носительфермент снова промывают водой, 1 М раствором хлористого натрия и водой и опять измеряют рерментативную активность. Зти операции повторяются несколько раз, Для сравнения фиксируют папани на том же носителе в водной среде при 40 С 7 ч. После промывания измеряют ферментативную активность указанным способом. Результаты (в мкг свободных пептидов на мл/мин) представлены в табл, 2.Как видно из табл, 2,фиксация папаина в гексане более быстрая, а количество фиксированного фермента в 10 раз больше, чем в воде. П р и м е р 3. Фиксация трипсина на кирпиче, Повторяют опыт примера 2, заменяя папаин .трипсином, Полученные результаты приведены в табл. 3,Как видно из табл.З,фиксация трипсина в гексане более быстрая, чем в воде, количество фиксированного фермента высокое, и фермент более стабилен,Комплекс носитель-фермент, полученный в гек. сане, относительно стабилен, несмотря на последо. вательиые промывания, вредные для комплекса. Эта стабильность еще более велика, когда комплекс применяют непрерывно,5 10 15 2 В 25 36 35 40 45 50 55 60 Так,50 г комплекса активный кирпич - трип. сии, приготовленного, как указано выше, помещают в колонку, где поддерживают температуру 37 С. Через колонку непрерывно пропускают З о ныл раствор (по весу) казеина в фосфат-цитратном 0,025 М буферном растворе с рН 7 в течение 15 ч со скоростью 60 мл/ч. Все 24 ч проводят измерение активности указанным способом. Через 15 ч активность уменьшается только на 5 о. Это хорошо демонстрирует стабильность предложенных комп. лексов.П р и м е р 4. Фиксация рибонуклеазы на поли. бутадиене,Поли бутаднен активируют реакцией с хло. ристым ацетилом.20 мг фермента суспендируют в 50 мл бенэола, прибавляют 2 г активного полибутадиена, получен. ную суспензию нагревают до кипения и выдержи. вают нри этой температуре 1 ч. За фиксацией фер. мента следят при помощи ИК-спектроскопии. Полоса поглощения 1720 смкарбонильной группы, которая присутствует в активном полибутадиене, исчезает в процессе фиксации, в то время как появляется полоса поглощения 1640 см , которую приписывают иминной функции. После разделения полученный комплекс носителы фермент лромы. вают 20 мл карбонатного буферного раствора с рН 10,5 для удаления адсорбированного фермента. За. тем измеряют активность фиксированного фермен. та по отношению к рибонуклеиновой кислоте (РНК), 20 мг полученного комплекса носитель- фермент суспендируют в смеси 1 мл 0,2 М трпс.бу. ферного раствора с . рН 7,8, содержащего 0,02 М этиленднаминотетрауксусную кислоту, 1 мл воды и 1 мл водного раствора РНК такой концентрации, чтобы она составляла 3,3 мг РНК на 1 мл смеси. Суспензню выдерживают 2 мин при 37 С, затем прибавляют 1 мл реактива Файдена и оставляют на 15 мин при 0 С и центрифутируют 5 мин со скоростью 6000 об/мин при 3 С, чтобы отделить избыток РНК. Оставшийся раствор разбавляют в отношении 1;30 и измеряют поглощение при 260 мм, сравнивая с носителем без фермента. Ферментатив. ная активность соответствует 1,2 мг активного фермента на 1 г носителя.П р и м е р 5. Фиксация глюкоамилаэы на крем. неземе.Кремнезем с поверхностью 15 м/г активируют путем. прнвивочной сополимеризации с силаном, имеющим эпоксидную функцию,1 г активного носителя прибавляют в 50 мл дисперсии хлороформа, содержащей 20 мг глюко. амилазы, Полученную суспензию нагревают с обрат. ным холодильником 2 ч, После охлаждения полу. ченный комплекс декантируют, сушат и промывают 3 раза по 20 мл дистиллированной водой и затем промывают в течение 24 ч 20 мл 2 М раствора хлористого натрия при 4 С. Для сравнения тот же опьп проводят в водной среде с 50 мл ацетатного 0,1 М буферного раствора с рН 4,5, содержащего578893 20 мг глюкоамилазы и 1 г того же носителя, Раст.вор иеремеипвают при 4 С 66 ч. После декантациии промывания, как указано выше, измеряют актив.ность. Полученные комплексы носитель-ферментвносят в 1 О мл ЗЪного по весу раствора крахмала 5в ацетатном 0,1 М буферном растворе с рН 4,5 иперемешивают 10 мнн при 40 С. После отделенияопределяют количество восстановленного сахара вжидкой фазе колориметрическим методом, приме. Т а блица 1 47,0 47 27,5 24 47 47 47 69 0 50 Бензол 44,5 39 28 32 36 Вода Табл и ца 2 1,0 0,1 3,2 0,3 ГексанВода 1,6 0,2 Таблица 3 4,8 0,6 2,6 0,3 Ге ксанВода 1,4 0,1 Таблица 4 0,564 0,120 ХлороформВода 0,800 0,180 2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что 55в качестве фермента используют оксндоредуктазу, трансферазу, гндролазу, лиаэу, изомеразу, лигазу.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтов качестве носителя используют минеральное, органическое нли органоминеральное вещество, не растворимое в органической среде и обладающее реак.цнонноспособными функциональными группами Формула изобретения 1, Способ получения яммобилизованных фер. ментов путем контактнровання фермента с актнвнрованным носителем, о т л н ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности фермента, связан. ного с носителем, процесс ведут в среде безводного апротонного растворителя прн 30" 120 С,няя 3,5 линитросалициловую кислоту. Г 1 оследовательно проводят несколько промываний и измере.ннй активности. В табл. 4 приведены результаты,выраженные в величине оптической плотности. Как и в предыдуших опытах, время фиксации глюкоамилазы в хлороформе меныне, чем в воле, а полученные комплексы более активны и более стабильны,578893 Составитель А. БочаровРедактор В. Мнрзаджанова Техред М, Келемсш Коррекгор Л. Небола Заказ 3833/708 Тираж 553 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР до делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-З 5, Раушская иаб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Просктиая, 4 при помощи которых могут фиксироваться фер. менты.4. Способ по п. 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что носитель представляет собой кирпич, кремнезем, окись алюминия, глину, песок, агарозу, крахмал, полидекстран, целлюлозу, полимеры. 5, Способ по п.1, отличающийся тем,чтов качестве органической среды используют углеводороды алифатические, пнклоалифатические, ароматические.6, Способ по п. 1, о тл н ча ющ и йс я тем, что процесс ведут в течение времени от нескольких минут до 2 ч.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. 2 аЬогв 1 су О, пипоЫ 11 гед Бпгугпев. "СВЯ. Ргеав", Сече 1 апд, ОЫо, 1973.