Способ биосинтеза амидаз

О П И С А Н И Е р 51578ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик) .1. Кл 2 С 12 Р 13/10 исоединением ваяв судврственный комитет вета Министров СССР о делам изобретенийи Открытий(23) Приорите бликовано 30.05.76, Бюл тень Хе 2(088.8) та опубликования описания 22.06,761) Заявитель 54) СПОСОБ ИНТЕЗА АМИДАЗ исло Изобретение относится к области микробиологической промышленности, а точнее к биосинтезу амидаз, преимущественно 1-аспарагиназы и бензилпенициллинацилазы.Известен способ биосинтеза амидаз путем непрерывного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Езс 1 тепсЫа со 11 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.Недостаток известного способа заключается в том, что проводимый процесс не обладает стабильностью при изменении скорости протока. Кроме того, для культивирования микроорганизмов используют питательную среду на основе дорогостоящего дрожжевого экстракта без сахаров при поддержании в строго определенных концентрациях лимитирующего субстрата, в качестве которого используют промежуточные продукты, например, глюкозу или глицерин, вследствие чего изменение содержания глюкозы в исходной среде с 1,5% до 1,75/о снижает выход продукта на 20/о, а изменение скорости протока с 0,15 час -до 0,28 час -приводит к уменьшению съема фермента в 50 раз.С целью обеспечения стабильности процесса по предлагаемому способу культивирование осуществляют при поддержании парциального давления к рода в среде не выше 2 мм рт. ст.Способ осуществляют следующим образом.Биосинтез амидаз, например /-аспарагиназыи бензилпеницпллинацилазы, проводят в условиях непрерывного одностадпйного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Езсйепс 111 а со 11 штамм 980, на питательной среде, содержащей источники углерода, О азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов пз культу- ральной жидкости. Культивирование осуществляют прп парциональном давлении кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.5 Способ апробирован в лабораторных услоП р и м е р 1. Проводят биосинтез бензилпенициллинацилазы, используя штамм АТСС 9637 Езс 1 епс 111 а со 11. Культуру поддержива- О ют в пробирках со скошенной агаризованнойпитательной средой из 2,о (по сухому весу) кукурузного экстракта и 1,5% агар-агара.Пробирки инкубируют 18 час при 37 С.Засев осуществляют смывом с косяков из 5 расчета 0,12 мг клеток (по сухому весу) на1 мл питательной среды, в качестве которой используют 1 вес. /О раствора кукурузного экстракта с добавлением 0,1 вес. о/о фенилуксусной кислоты, рН 7,2 - 7,3 после стерилиза- О цип.Непрерывное культивирование проводят в аппарате типа МКВ при объеме загрузки 1 л при 24 С. Содержание растворенного кислорода определяют датчиком. Поток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 2 - 4 час после засева, После включения протока подбирают условия аэрации и перемешивания таким образом, чтобы парциальное давление растворенного кислорода не превышало 2 мм рт. ст. Зтому требованию соответствуют скорость вращения двухлопастной магнитной мешалки 900 об/мин и расход воздуха - 0,8 л/мин.Непрерывную ферментацию бензилпенициллинацилазы проводят 100 час,При протоке среды 0,15 час -(150 мл/час) получают культуральную жидкость с содержанием клеток 1,50,1 мг/мл с удельной активностью фермента 13,0+0,5 ед/мг сухого веса клеток, . а при протоке 0,1 час -(100 мл/час) - с содержанием клеток 1,8-+ 0,1 мг/мл с удельной активностью 16,0-+ 0,5 ед/мг сухого веса клеток,Активность фермента определяют модифицированным методом Сватека.Контрольный периодический процес ьедут 18 час на той же среде и том же посевном материале в колбах Зрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл стерильной среды при 24 С на круговой качалке при скорости вращения 220 об/мин. К концу процесса получают 3,8 мг/мл клеток с удельной активностью 7,2 ед/мг сухого веса клеток.Таким образом, производительность непрерывного процесса съема фермента с единицы объема загрузки питательной среды в единицу времени практически не изменяется при изменении протока в 1,5 раза и составляет, примерно, 0,3 ед/мл час против 0,15 ед/мл час в периодическом процессе (без учета времени на подготовку аппарата к ферментации в последнем).Удельная активность фермента увсличивается в 2 - 2,5 раза, что способствует повышению производительности на стадии химической очистки бензилпенициллинацилазы.П р и м е р 2. Проводят биосинтез /-аспарагиназы, используя штамм 980, получснный в лаборатории культур продуцентов ВНИИА. Культуру, хранившуюся на мясо-пептонном агаре, используют для за:ева колб с посевной стерильной средой, в качестве которой берут 4 вес. % кукурузного экстракта и 0,1 вес. % гидролизата казеина (по аминному азоту).Посевной материал выращивают па круговой качалке (220 об/мнн) 15 - 18 час при 28 С, Питательные ферментационные среды засевают посевным материалом из расчета 0,1 - 0 5%.Биосинтез 1-аспарагиназы проводят на среде, содержащей 8 вес. % к курузного экстракта и 0,1 вес. % сульфата аммония, рН стерилизации 7,3 - 7,5,Непрерывное культивирование ведут в ферментере типа Е 1.-103 (В 1 О 1 ез) при объеме за 5 1 55 20 25 30 35 4 О 45 50 55 60 65 грузки 2 л при 28 С. Растворенный кислород измсряют с помощьо прибора 1 Р - 100 - 8 (В 1 о(ез), Проток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 3 - 5 час после засева. Условия аэрации и перемешивания соответствуют поддср 2 кянию парциа;1 ьного давления кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.Непрерывную ферментацию 1-аспарагиназы проводят 160 час при протоке среды 0,5 час - , расход воздуха 2 л/мин, скорость вращения мешалки 575 об/мип, Получают культуральную ж;1 дкость с содержанием клеток 3,3+ 0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 1,50,1 МЕ/мг клеток аспарагиназы.При протоке среды 0,25 час -(0,5 л/час) поддерживают расход воздуха 2 л/мин и ско рость вращения мешалки 420 об/мин, при этом получают культуральную жидкость с содержанием клеток 3,5+0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 2,8 0,2 ед/мг сухого веса клеток.Контрольный периодический процесс проводят в колбах Эрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл среды при 28 С на круговой качалке при 220 оо/мин. На 15 час культивирования получают 4,1 мг/мл клеток с удельной активностью фермента 1,6 ед/мг сухого веса клеток.Таким образом, производительность непрерывного процесса практически не изменяется при изменении протока в 2 раза и составляет -2,5 ед/мл в 1 час против 0,65 ед/мл в 1 час при периодической ферментации, т. е. примерно в 4 раза выше, даже без учета времени на вспомогательные операции в последнем.П р и м е р 3. Процесс биосинтеза 1-аспарагиназы ведут, как в примере 2, используя штамм С 1 Езс 11 ег 1 СЫа со 11.Ферментацию проводят 100 час, последовательно заменяя через каждые 36 час культивирования питательную среду, приготовленную на основе трех различных партий кукурузного экстракта с содержанием углеводов в последнем 0,7, 2,4 и 4,2% (по сухому весу экстракта).Прп протокс 0,25 час -(0,5 л/час) расход оздуха 1,5 л/мин, скорость вращения мешалки -150 об/мин. Получают культуральную жидкость с содержанием клеток 3,3+0,2 мг/мл (по л хо.,1 у весу) при удельной активности фсрмснга 3,34-0,2 сд/мг сухого веса клеток.В контрольном периодическом процессе на18 час культпвпрования получают 3,65 мг/мл клеток с удельпсй активностью 3,8 ед/мг.П р н и е р 4 цл 11 биосинтеза /-аспарагиназы нспользу 1 от к,льтуру Егюп 1 а саго 1 очога, котоэгю о 1, согх 11 ва 1 от на скошенном мясопег 1 тзн 11 о,: Иваре и засевают колбы с посевной стеонльной С 1;едой, в качестве последней используют ",%-пый кукурузный экстракт (по техп 11 ц 1 ес 1 ому весу), 0,1 /о-ный гидролизат казеипа (по ами 1 ому азоту). Посевной мате515781 Формула изобретения Составитель А. БражниковаРедактор Н. Спиридонова Техред М. Семенов Корректор Т. Добровольская Заказ 1356/15 Изд,1368 Тираж 575 Подпи снос ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Мшшстров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 риал выращивают на круговой качалке 15- - 18 час при 37 С. Питательные ферментацнонные среды засевают посевным материалом в количестве 0,1 - 0,5%.Биосинтез /-аспарагиназы проводят на среде, содержащей 8 вес. о/, кукурузного экстракта, 0,1 вес. % сульфата аммония, рН для стерилизации 7,5, Непрерывное культивирование ведут в аппарате типа МКВ, загружая 1 л при 37 С. Содержание растворенного кислорода контролируют датчиком ВНИИА. Поток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 5 час после засева. После включения протока устанавливают условия аэрации и перемешивания таким образом, чтобы парциальное давление кислорода не превышало 2 мм рт. ст. В данном примере этому соответствует скорость вращения мешалки 1100 об/мин и расход воздуха 1 л/мин. Непрерывную ферментацию проводят 120 час.При потоке среды 0,5 час -(500 мл/час) получают культуральную жидкость с содержанием клеток 1,3-1-0,1 мг/мл с удельной активностью фермента 9,0+0,5 ед/мг сухого веса клеток. При протоках 0,25 час -и 0,15 час -содержание клеток в вытекающей культур альной жидкости 1,8+-0,1 мг/мл с удельной активностью 12,0+.0,5 ед/мг сухого веса клеток и 18,50,5 ед/мг сухого веса клеток, соответственно. 1 М 1 трольный ц цспцодцческцй процесс ведут 15 час в колба. 311 лснмейера сбьемом 750 мл, загружая 100 мл стерильной среды п 1 зц 37"С ца кртовой качалке. К коцц про цесса получ а юг клетки концсцтрщцц2,5 мг/мл с удельной актцвцость 1 о 7,8 ед/мг (сухого веса),Таким образом, процзводцтсльцость непрерывного процесса не изменяется прп колеба ниях состава питательной среды ц составляет2,7 ед/мл час против 0,8 ед/мл час прп периодической ферментации, т. е. в 3,5 раза выше (без учета времени. необходимого для подготовки аппарата к ферментаццц в периодиче 1 о ском процессе). 20Способ бцоспнтеза амцдаз путем непрерывного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Евс 1 ег 1 с 111 а со 11 на питательной среде, содержащей цсточццкц угле рода, азота п минеральные соли. прц аэрациис последующим выделением ферментов пз культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ п й с я тем, что, с целью обеспечения стабильности процесса, культивирование осуществляот прц 30 поддержании парццального давлсцця кислорода в среде пе выше 2 мм рт. ст.