Способ получения антиген-активного маннанпротеина

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(51) М,Кл.- А 61 К 39/ сударственный комитет вета Министров СССо делам изобретений(088.8) и открытий Дата опубликования описания 11.08.7 2) Авторы изобретени С. И. Бидненко и Д, Е. Дыхови 1) Заявитель научно-исследовательский институт эпидемиологи микробиологии и паразитологии вс30 Изобретение относится к технологии получения антигенных препаратов, а именно маннанпротеина, используемого в амбулаторнойпрактике для диагностики кандидозов, а также в качестве тест-,препарата в научных исследованиях,Известен способ получения антиген-актнвного маннапротеина из грибов Сапйдаа 1 Ь 1 сапв, заключающийся в том, что биомассу отделяют от культуральной среды, клетки 1 Омеханически дезинтегрируют, клеточные стенки изолируют дифференцированным центрифугированием, маннанпротеин экстрагируютраствором КОН. Выход целевого продукта составляет 1,оо от веса сухой биомассы грибов (1).Известен также способ получения маннанпротеина из дрожжей, включающий механическую дезинтеграцию клеток, отделение клеточных стенок дифференцированным центрифугированием, экстракцию маннанпротеина этилендиамином с последующим выделением целевого продукта с выходом около 1,Осо от весасухой биомассы (2).Однако эти способы трудоемки и не обеспечивают высокого выхода препарата.Целью изобретения является повышениевыхода препарата и упрощение способа,Это достигается тем, что экстракцию осуществляют ультразвуком, полученный экстракт лнофнлнзнруют, далее лнофнлнзат растворяют в воде, затем водный раствор лпофилизата фракционнруют на геле декстрана и элюнруют водой. Кроме того, экстракцию ультразвуком проводят при частоте 15 - 30 кгимощности 100 - 50 вт в течение 10 - 20 мин.Способ осуществляют следующим образом.Выращенную на сусло-агаре в течение 48 час грибную массу СапдЫа а 1 Ь 1 сапз смывают с питательной среды, трижды промывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируя прн 2000 - 3000 об(мин в течение 30 мин. Затем готовят взвесь отмытых клеток в дистиллированной воде из расчета 30 - 50 мг влажной массы в 1 мл. Взвесь подвергают ультразвуковой обработке в аппарате при частоте 20 кги в течение 15 мин. Можно также обрабатывать клетки прн частоте 800 - 1000 кги, мощности 5 - 10 вт/см в течение 1.5 - 2 час.Обработка ультразвуком в таком режиме позволяет извлекать локализованный в клеточнон стенке маннанпротенн при минимальном разрушении клеток. Бактериологический и микроскопический контроли регистрируют прн этом не более 1 О - 12% разрушенных клеток. Озвученную взвесь центрифугируют при 6,500 - 8000 обмин в течение 30 мин для удаления клеток и их обломков. Недосадочнуюжи,"кость лпофилизируют, при температуре 25 С и остаточном давлении 70 - 80 лья рт, ст, в течение 144 час. Выход полупродукта антигенактивного маннанпротепна составляет 15 - 20% от веса сухой биомассы. Очистку полу продукта производят гельфильтрацией водного раствора лиофилизата через гель декстрана, например, сефадекса Г, при этом максимально сохраняется нативная структура целевого продукта. Элюцию маннанпротеина 10 осуществляют водой. Контроль фракций производят спвктрофотометричеоки при л - 280 ялс. Первая высокомолекулярная фракция, содержащая целевой продукт, лиофилизируется.Применение ультразвука в качестве эстра гирующего средства в сочетании с лиофплизацией и последующей гельфильтрацией представляет собой новый законченный технологический способ, приводящий к новому положительному эффекту, а именно полученшо вы сокоактивного маннанпротеина, содержащего около 90 О/О сахарР, более 60% которого представлено маннозой, и 5 - бо/о белка. Благодаря исключению стадии изоляции клеточных стенок из биомассы грибов и предложенному 25 условию выделения маннанпротеина способ его получения существенно упрощается, а выход увеличивается в 3 раза и составляет 3/о от веса сухой биомассы. Полученный лиофилизированный препарат сохраняет антигенную Зо активность при 4 С на протяжении двух лет,П р и м е р. 1,25 г влажной биомассы грибов С. аЬсапз, выращенной на сусло-агаре в течение 48 час при 37 С, промывают 4 раза 50 лл стерильного физиологического раствора, центрифугируют при 3000 об/мия в течение 30 мия, Затем готовят 25 лил взвеси отмытых клеток в дистиллированной воде из расчета 50 лг влажной биомассы на 1 лсл н подвергают смесь ультразвуковой обработке в 40 аппарате М 5 Е% Са 1 КОКСпри частоте 20 кгг 1 в течение 15 мия. Озвучешую взвесь центрифугируют при 7000 об/мия в течение 30 мия. Полученную опалесцирующую недосадочную жидкость в объеме 25 лл, : - 45 бодную по данным микроскопического и бактериологического контроля от неразрушенных клеток и их обломков, лиофилизируют при температуре 25 С, остаточном давлении 70 - 80 мм рт. ст. в течение 144 час. В результате 50 получено 50 люг полупродукта антиген-активного препарата с выходом 18% от веса воздушно сухой грибной массы. Для дальнейшей очистки полупродукта анпиген-активного препарата 50 лгг лиофилизата растворяют в 55 0,5 лл дистиллированной воды и полученный раствор фракционируют гельфильтрацией чер з колонку с сефадексом Г, Высота колонки 55,0 сл, диаметр 1,8 сль Маннанпротеин элюируют водой со скоростью 1 О - 15 млчас, при этом объем отбираемых для анализа проб составлял 3,5 - 4,0 мл. В каждой пробе измеряют оптическую плотность растворов при Х - 280 ял на спектрофотометре СФИА. Полученную при гель-фильтрации первую фракцию лиофилизата в объеме 15 лл, являющуюся раствором маннанпротеина, сушат лиофилизацией в камере Долинова при указанном режиме и получают 7,5 лг препарата, что составляет 3,1 О/о от веса сухой биомассы. Препарат содержит 92,4 О/о сахара, 70% которого гредставлено маннозой, и 4,8% белка.Предложенный способ технологически прост, не требует сложной аппаратуры и позволяет повысить выход антиген-активного маннанпротеина в 3 раза по сравнению с известными способами и получать препарат в количествах, необходимых для диагностики кандидозов в широких масштабах.Испытания показали, что иммунологическая активность полученного препарата превосходит активность применяемых для диагностики полисахаридных препаратов, выделеняьх химической экстракцией, в реакции связывания комплемента в 8 раз, пассивной гемагглютинации в 2 раза, встречного иммуноэлектрофореза в 2 - 4 раза.Формула изобретения1. Способ получения антнген-активного маннанпротеина путем выращивания дрожжей или дрожжеподобных грибов на питательной среде, отделения биомассы от культуральной жидкости с последующей экстракцией и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода препарата и упрощения способа, экстракцию осуществляют ультразвуком, полученный экстракт лпофилизируют, далее лиофилизат раство;яют в воде, затем водный раствор лиофилизата фракционируют на геле декстрана и элюируют водой.2, Способ по п. 1, отли ча ющи йся тем, что экстракцию ультразвуком проводят при частоте 15 - 30 кгпв, мощности 100 - 150 вг в течение 1 О - 120 лшя,Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.1. 1. В 0 орса сйегпЫгу, 1959, М 9, 234. р, 2281.2. 1, В 10 орса сйегпв 1 гу, 1960, 75, р. 12.