Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител

(ф СЛКЛ СО(Ц 1 СКИХСОЦИАПИСТИЧЕСКИХРГСПУВПИК РЕТЕН ЬСТ едователь енский на институ медицин-исс Тур ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(46) 07.05;93. Бюл. М 17 (71) Туркменский научно ский институт онкологии и учно-исследовательски профилактической и клини (72) Х,П.Кадыров и Я.Пирле (56) Мейа М,М, ет а )Гп аЙ Гпопос)опа аптИоб)е саасеб з)без:ап а)тегпатнн гпейобз. Вцт. - 1983.-н,47. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКО НИЯ ИММУНОКОМПЕТЕН ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОН АНТИТЕЛ и т еской ы коввц пойцогезсепсе з ап ро)- -)б)пе е то сопнептопа - М 5. - рр.237. КИ ПРЕПАРАТА ГО ИССЛЕДОВАТНЫХ КЛЕТОК С ОКЛОНАЛЬНХ Изобретение относится к технике проведения иммунологических реакций и может быть использовано при иммунодиагностике лейкозов и для определения субпопуляции лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител (МКА),Цель изобретения - повышение эффективности и качества исследований за счет ликвидации дефицита времени при иммунофенотипировании клеток МКА. возможность систематизации большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества пациентов непосредственно в месте Их проживания с последующим проведением исследований в лабораторных условиях, при этом снижается стоимость исследователь, Я 21814074 А 151)з 6 01 М 33/53(57) Использование: в медицине, в частности в технике проведения иммунологических реакций, Сущность изобретения; получают клеточную взвесь из чистой популяции иммунокомпетентных клеток, наносят ее на предметное стекло, инкубируют при комнатной температуре, прикрепляют клетки к предметному стеклу с последующим ингибированием активности эндогенной пероксидазы клеток раствором перекиси водорода и проведением иммуноферментной реакции, При этом прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течении 10 мин в 100;4-ном растворе ацетона, (, " охлажденномдо 0-(+5) С. Способ прост в исполнении и не требует импортных реактивов, (д 1 з, и. ф-лы. 3 табл. ских работ за счет исключения из методики поли-:лизина,Поставленная цель достигается тем, что в способе подготовки препаратов для микроскопических исследований иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител, включающий взятие пробы у донора, выделение чистой популяции иммунокомпетентных клеток, прикрепление клеток к предметному стеклу, ингибирование активность эндогенной пероксидазы клеток и нанесение на клетки моноклональных антител, отмывка последних и нанесение вторичных антител меченой пероксидазой, ее отмывка, проявление резуль)атов реакции с помощью раствора 3 -З-диаминобензидина,(модифицируется этап прикрепление клеток к предметному стеклу,т,е. в место ранее применяемого для этой ц( ли поли- -лизина10 15 20 25 30 35 40 заменяют фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до О+5"С 100%-ном ацетоне, По мнению автора операция фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до О+5 С 100%-ном растворе ацетона придают способу новые свойства; удлиняет срок сохранности препарата,что позволяет расширить масштабы применения способа во времени, в пространстве (брать пробы у большого количества людей на периферии, а обрабатывать препараты и систематизировать исследования - в центральной лаборатории),Способ осуществляется следующим образом,После выделения чистой популяции иммунокомпетентных клеток (лимфоциты, клетки костного мозга) иэ них готовится клеточный взвесь, так чтобы в 1 мл среды 199 содержали 8 - 10 млн клеток, Затем по 50 мкл клеточной взвеси вносится в каждую парафильную лунку предметного стекла. После этого предметное стекло с клетками инкубируется при комнатной температуре на 20 мин для осаждения клеток к стеклу. Надосадочную жидкость отсасывают и предметное стекло помещают в стакан, содержащий 100%-ный раствор ацетона, охлажденный до 0.+5 С. Клетки в ацетоне фиксируются в холодильнике в течение 10 мин, После этого клетки высушиваются в воздухе, и таким способом фиксированные клетки можно хранить длительное время (6 - 8 суток) или ке сразу начать исследования. Но прежде чем начать исследование, проводят регидратацию с помощью инкубирования клеток в среде 199 на 10 мин при комнатной температуре, Такой препарат испытан авторами иммуноферментном методом для определения иммунологического подварианта острого лимфобластного лейкоза и для субтипирования лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, Исследование проводили с использованием отечественных моноклональных антител серии ИКО, предоставлены д.м.н. Барышниковым Л,Ю, и приобретены у кооператива "БИОЛАМ" ВОНЦ АМН СССР, г, Москва, Ниже приводятся специфичность испольаованных в работе МКА, 50 П р и м е р 1, У здорового донора М,(порядковый М 1 в таблице 2) из локтевой вены была взята кровь для определения субпопуляции лимфоцитов. Цельную кровь разводили 1;3 средой 199, наслаивали на градиент фиколл-верографина (9 обьемов крови за 3 обьема градиента) и центрифугировали при 170 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали из интерфазы пастеровской пипеткой. Клетки трижды отмывали средой 199 с помощью центрифугирования. Затем в каждую лунку 2 предметных стекол вносили по 50 мкл 1 х 10 /мл исследуемых клеток. Клет 6ки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, среду отсасывали и предметные стекла помещали в охлажденном растворе ацетона при 5"С на 10 мин в холодильник.С одним из препаратов сразу начали проводить исследование, второй хранили в холо.- дильнике в течение недели, Первый препарат отмывали в среде 199 за 10 мин, Ингибировали эндогенной пероксидазой клеток с помощью 3%-ного раствора Н 202 в течение 10 мин, Затем на препарате проводили иммуноферментную реакцию по следующей схеме; на клетки наносили МКА на 30 мин, вторичная антисыворотка против иммуноглобулинов мыши, меченая пероксидаэой, 30 минут. Все этапы инкубации осуществляли во влажной камере при комнатной температуре. После каждого из них клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не давая. клеткам высохнуть, наносили следующие реактивы. После всех этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-диаминобензидина.Раствор диаминобенэидина готовили "ех 1 етроге" (0,5 мг мл с добавлением 2 мкл 33%-ной перекиси водорода), Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемую НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н,Ф,Гамалеи, г, Москва, использовали в разведении 1:20, Оценка полученных результатов показала, что уданного донора ИКР+ клетки составляют 22% от общего числа клеток в препарате, ИКО72%, ИКО 31 21% ИКО46%ИКО28%, МКО 88%. Полученные данные с помощью нашего способа согласуется с данными других авторов, которые. получили с применением поли- -лизина. Аналогичные параллельные исследования с применением поли- -лизина у данного же донора показали тот же результат. Через .8 дней повторяли исследование с препаратом, хранившимся в холодильнике, и получали идентичный результат, Признаков разрушения клеток и неспецифического окрашивания не наблюдали. В препарате с поли- -лизином по истечении 8 дней наблюдались прорось в препарате. большинство клеток было разрушено, некоторые разрушились частично, видны только "обломки" клеток, Наблюдается неспецифическое окрашивание клеток в виде диффузной сорбции антител веществами разрушенных клеток, Для убедительности полученных данных те же исследования были проведены у 10 здоровьях доноров, Ре40 ли:лизина,45 50 55 эультаты этих исследований представлены в табл, 2,Как видно иэ табл, 2, принципиальных расхождений в результатах по обеим методикам не наблюдалось. П р и м е р 2, У больной А табл. 3) цито- логически подтвержденный диагноз - острый лимфобластный лейкоз. Проводили определение иммунологического подвариэнта заболевания с применением МКА. Костно-мозговый пунктат поместили в среду 199, содержащую раствор гепарина (50 ед/мл). Содержащиеся в нем эритроциты лизировйли с помощью гипотонического раствора, Отмывали клетки в среде 199 три раза.,Затем в каждую лунку 2 предметных стекол вносили по 50 мкл 1 х 10 /мл исследуемых клеток. Клетки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, Среды отсасывали, предметные стекла помещали в охлажденный раствор ацетон при 0 С, С одним из препаратов сразу начинали проводить исследование, второй хранили в холодильнике 6 суток, Проводили регидрирование клеток с помощью инкубации препарата в среде 199 за 10 мин, Ин гибировали активность эндогенной пероксидазы клеток в растворе Н 202 в течение 10 мин. Затем проводили иммуноферментную реакцию по следующей схеме; на клетки наносили МКА на 30 минут, затем вторичную ангисыворотку против иммуноглобулиноа мышей, меченные пероксидазой - ЗО мин, Все этапы инкубации осуществляли во влажной камере при комнатной температуре, После каждой инкубации клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не давая клеткам высохнуть, наносили следующие реактивы. После проведения всех этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-диаминобензидина. Раствор диаминобензидина готовили "ех репроге" (0,5 мгl мл с добавлением 2 мкл 33%-ного Н 20), Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемой НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, г,Москва, использовали в разведении 1:20. Оценка полученных результатов показала, что доминирующие количества бластных клеток экспрессируют Т- клеточные антигены, На основании этих данных был поставлен диагноз Т-клеточный зариант острого лимфобластного лейкоза. Аналогичные параллельные исследования с применением полилизина показали тот же результат, Через 6 дней повторно исследовали препарат, хранившийся в холодильнике., и получили идентичный результат. Признаков разрушения клеток, неспецифического окрашивания или каких-нибудь ар 5 10 15 20 25 30 35 тефактов не наблюдали. В препарате с поли-Е-лизином по истечении 6 дней наблюдалась пророст, большинство клеток было разрушено, некоторые час-,ично разрушились, видны "обломки" клеток. Наблюдается также неспецифическое окрашивание препарата в виде диффузионной сорбции антител веществами разрушенных клеток, Для убедительности полученных данных параллельные исследования были проведены у 12 бальных с острыми лимфобластными лейкозами. Результаты данного исследования представлены в табл. 3,Как видно из данных табл. 3, принципиальных расхождений в результатах, полученных с применением обеих методик, не наблюдалось.Предлагаемый способ имеет ряд преимуществ перед способом с применением поли- -лизина, Главные иэ них - общедоступность раствора ацетона, в противоположность дорогостоящей импортной поли-:лизина, Кроме того, описанный способ сокращает рабочее время, препараты, подготовленные этим способом можно хранить 6-8 дней в холодильнике и ставить иммунологические реакции одновременно большим количеством случаев, спланировать работы на перспективу, набрать материал непосредственно на местах проживания больных и проводить исследования в лабораторных условиях, возможность применения исследования при профилактических осмотрах, переставлять реакции на одном и том же случаях с возможностью возвращения описания результатов исследования, что невозможно при использовании способа с применением поФормула изобоетения 1. Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител путем получения клеточной взвеси из чистой популяции иммунокомпетентных клеток, нанесения ее напредметное стекло, инкубации при комнатной температуре, прикрепления клеток к предметному стеклу, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течение 10 мин в 10000-ном растворе ацето-. на, охлажденном до температуры 0-50 С,2, Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и й ся тем, что регидратацию клеток осуществляют путем их инкубирования в среде 199 в течение 10 мин при комнатной температуре,1814074 Таблица 1 Специфичность моноклональных антител Т а Результаты параллельного проведения субтипирования лимфо доровых доноров с помощью моноклональных антител предласпособом и с применением полилизинаЪ итов емы КО ИКОИКОКО8 О оно 6 3.1 2 3 9 содержание антиген положительнцх клеток принаменателе-о/о-ное содержание антиген положиина,П р и м е ч а н и е: в числителе-о/о-нфиксировании в охлажденном ацетоне, ельных клеток при применении поли:л результаты параллельното проееденил иммунофенотипнроеанил клострым лимфобластным лейкозом с помощью моновюнальнык аититприменением полн 4:лизина абли к костното моете у больныкел прейлзгаемым способом и КО 35 ИКО 87 0.12 ИКО. И КОзаболеааиил и ноломческий поТ-клеточн ольн 4/4 8/В 3-3 2/2 0/О 48/4 58/5 560 50/4 80/78 88/85 92/93 81/83 3/3 33/30 29/30 30/23 30/31 О/О 2/2 т-клзточи 3/3 5/5 В/6 4/4 7 3/33/138/66/68/183/13 94/ 85/ 3/3 О/О О/О О/ООВщ йО Нулееой Олеаой О/10 нине окл Л р н и е ч а н н е: а числителеиое солерианне антигон полоиительнык клеток прн фиксы ацетоне, е знаменателенее содернание знтитеи полоиительнык клеток вкленном поли 4:лизина. В/8 38/39 21/22 22/23 38/3737/ЗВ 63/64 32/33 56/59 55/57 23/24 23/22 21/22 20/21 22/21 21/20 25/24 20/19 28/26 30/29 28/27 21/23. 71/71 70/69 73/72 72/73 69/70 75/74 66/64 70/73 , 71/71 60/66 3/3 7/7 2/2 11/11 78/73 83/83 3/3 В/8 7/7 6/6 19/20 21/20 25/23 23/2224/21.21/25 24/23 20/22 22/23 1 О/1 О17/1811/122/23/318/2011/11,Э/35/5 45/46 44/46 43/42 .46/45 43/42 45/46 46/45 43/44 47/45 45/43 27/28 30/31 28/23 25/24 30/31 27/26 32/35 30/31 33/34 22/23 ый ОЛЛ ый ОЛЛ ый ОЛЛ ый ОЛЛ ный ОЛЛ ный ОЛЛОЛЛОЛЛОЛЛ 89/88 98/93 95/96 97/95 93/96 95/94 96/95 98/95 92/93 99/96