Способ проведения ферментных реакций

ОП ЙСАНИЕ ИЗОБРЕТЕее ЙЯ ФфЕЭ Совфтекмх 1".оцмаямстмческмх Респубпмн) Приорите ееударетеекнык кемктетСеввта Мкнеетреа СССРее делам кзебрвтеееа еткрытхВ(088.8) ания описания 30.04.76. 5) Дата опубли Иностранецальдо Антони(Италия) 72) Автор иаобретен Иностранная фирм м Прогетти ф,п.А,и И.С1) Заявитель чиета Пер. Аэиони НТНЫХ РЕАКБИ В качестве приг ,органических раств довать следующие: вых кислот, имеющ Изобретение относится к медицине.Известен способ проведения ферментнь;хакций, заключающийся в том, что водныйаствор фермента подвергают контакту сВодным раствором субстрата.С целью повышения вы.хода целевогодукта в случае, когда субстрат незначительно растворим в воде, субстрат растворяютв органическом растворителе, не смешиваюшамси с водой,Как известно, раньше энзимные реакции.проводили только в водной среде. Дальней,шие исследования в этой области обнаружили возможность проведения энзимных пре,вращений, не растворимых в воде, посредством работы в водно-органических двухфазных. системах, характеризуемых тем, чоргатьческий растворитель (не смешиваюшийся в воде) является .хорошим растворителем для субстрата, по этой причине энэипроявляет действие в соответственной длянего водной окружающей среде, причем непосредственное цс.йствие со стороны растрителя при этом прекращается,да, просты 4 алки ль мовщнх 10 ат ные эфиры сп- лерода; али лоалифатичес10. ные углеводо иртов,атичес кие угл оды.5 мл этилацетатал эстрадиола (Э Пример 1 держащего 10 мг/м,ж,арего 0,060 мгт 6Смесь инкубо30 25 С при пем фазе содержДух. Через ротбирают 5во- эуют для ана35 продуктов. туре ируют при те ичем в газовой ремешивани итси ,чистый аэличные пр КИСЛОРОД ИЛИ ВОЭ- межутки времени мл органической фазы и исполь,лида эстралиола и возможных ПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ф одных для применения рителей можно рекоменсложные эфиры карбонох 2-15 атомов углеро ые эфиры спиртов, имею- углерода," сложные алкильимеюших 4-10 атомов - кие, ароматические и цитеводороды,галоидзамешейруют с равным объемо0,1 М (рН=5,4) содер мл(10 М, лакуаэы.504503 вый эфир, дихлорэтан) могут служить заменителями для этилацетата.П р и м е р 2, 3,2 мл фосфатного буфера, 0,2 М при рНа 7,6, содержащего 2,5 мл+И АД и О, 08 Н Я Д Н единиц эмульгируют с 3,2 мл органического растворителя, содержащего 13 мг тестостерона (Д 4 х 10 М)"опри температуре 22 С. Источником энзима является очищенныйвизим из жидкой среды, получаемой прикультивировании грибков РоЯУрогпэ оегвьсобф,Через 4 час:, при указанных выше услоЬиях проведения реакции- половинное колиЧество эстрадиола превращается в продукты,которые могут быть различены с помощьо.кроматографического анализа. При аналоГиных испытаниях, проводимых в отсутствии органического растворителя, при пасыаюнии .эстрадиолом ацетатного буфера, ко 1 ,вторый содержит лакуазу, было невозможнодоказать наличие реакций с применениемобычных методов,Несколько других органических раство- рваятелей, (например трихлорэтан, диэтилоСмесь перемешивают со скоростью 100качаний в 1 мини через разйЫчные промежутки времени определяют оптическую плотность водной фазы при 340 пт,Данные определения оптической плотности представлены в табл,1,Таблица 1. Оптическая плотность: при 340 пщ через Органический растворитель 2 часа 22 часа 1,4 ЭтилацетатБутилацетатЭтиловый эфирБутанол 3,4 1,3 3,2 088 3 . 30В случае отсутствия органического рас-, методу тонкослойной хроматографии с притворителя, общее возрастание оптической . ; менением в качестве средства для элюироплотности при 340 пюпограничивается рас-, вания системы этилацетат-бензол - н,гектворимостью тестостерона в воде (насышен сан (100: 80: 60).ный раствор, содержит 28-30 м/мл теЯосте В Стероиды экстрагируют с подложки -рона), Таким образом, при отсутствии орге" носителя хлороформом;в течение 24 час,нического растворителя, значение оптической, ,при комнатной температуре,плотности никогда не п)зевышало),примерно, После испареййяхлороформа стероиды0,3, анализируют с помощью спектрофотометраП р и м е р 3, 3 мл буферного раст- Ю при 240 в среде этанола.вора, содержащего окисленный КО-фактор Источником энзима является гидроксои пируват натрия, смешивают с двумя сво- стероид дегидрогеназа (НДН) из клетокбодными энзимами , ДН или М АДН, К вод- Рчепбоаопав 1 е 51 озетопь сеЕеному раствору добавляют равный объем ор- лактик дегидртеназа (д ДЯ) фирмы Беринганической фазы, содержащей стероид, и 5 гер.осуществляют эмульгирование двух фаз. П р и м е р 4. 5 мл раствора энзимаРеакцию проводят при встряхивании реак- встряхивают с 2,5 мл оливкового маслационной смеси при.90 качаниях в 1 мин,растворенного в 2,5 мл дихлорацтана, иЗатем развитие отдельных реакций уз- темперируют при 37 С в течение 1 час принают, определяя количества конвертированЖ .перемешивании,ного и неконвертированного стероидов, ко- , Через определенный промежуток времеторые присутствуют в органической фазе, ни добавляют 30 мл смеси равных частейВ заданные моменты времени фазы сме- ацетона с этанолом, затем растирают сшивают, отбирают точно определенный объ М углекислого натрия,ем органической фазы и определяют содер 55Результаты испытаний представлены вжание тестостерона и андростендиона по табл. 2,504503 Таблица 2. Испытание без эмульсии, без раствори;еля Испытание с растворителе м,Липаза, мг моли жирной кислоты, выделившиеся о эа 1 час при Э 7 С97206 14,4 28,8 280 310 43,2 400 57,6 Испытание 2., Далее испытание проводят с бенэолом.20 Для етого такую же реакционную смесь,как при испытании 1, инкубируют совмест,но со смесью 5 мл бутайопа и 5 мл бенозола при перемешивании при 20 С,25Результаты испытаний сведены в табл.3.,Таблица 3,.Оптическая плотность-при 340 птв Время,: мин,. Испытание 1Испытание 2 0,190 0,190 О 3,80 3,85 5,30 4,95 10 д,60 30 60 12,6 9,4 15,0 10,Э 16,3 11,4 180 11,7 300 1320 12,2формула изобретения 4 б Способ проведения ферментных реакций путем контакта водного раствора фермента и раствора субстрата, о т л и ч а ю -60 Составитель Т. Серебренникова(ТехредА,;Демьянова Корректор Л. Тромбола Редактор А. БерЗаказ 110 Тираж 551 Подписное ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий113035,Москва, Ж, Раушская набд. 4/5 филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 1П р и м е р 5. Испытание 1.Составляют реакционную смесь иэ 10 млполифосфатного буфера (0,1 М, рН=9), вкотором растворяют следуюшие вешества:12,5 мг семикарбаэида, 16,7 мг глицина,,3 Ы восстановленногогпютатиона, ЭО мгМАД. Смесь инкубируют совместнос 5 Мбутанола при перемешивании. 20,4ш и й с я тем, что, с цепью повышениявыхода целевого продукта в случае, когдасубстрат незначительно растворим в воде,