Способ получения иммобилизованной липазы

(51)5 С 12 й ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ при 4 С в течени язывач (1. е менто тками спасо ивность цел осителя) и н я полуинак а является низкая во го продукта (0,8 евысокая стабильивации 2,5 ч при ее близким му решению и тигаемому по ется спосо олиамидном в качестве б о реагента госпособу об к предлагаемомуо техническои сущ ложительному эфб иммобилизации носителе с испольифункционального ссипола. Согласно работку носителя ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт микробиологии АН УЗССР (72) К.Д, Давранов, А,С. Саттаров и М.Я, Табак(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилиэованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической отраслях промышленности. Цель изоИзобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к способам получения иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической промышленностях.Известен способ получения иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя бифункциональными реагентами, в качестве которых используют глутаровый альдегид или госсипол.Обработку носителя глутаровым альде-. гидом проводят при рН 8,5 в течение 1 ч, а бретения - повышение активности целевого продукта, Способ заключается в обработке полиамидного носителя - капрона бифункциональным агентом, несущим изоцианатные группы, а именно 2,4-толуолдииэоцианатом (1-2 мг на 1 г носителя) в нейтральной или слабощелочной среде с последующим присоединением остатков.пальмитиновой кислоты в количестве 20-30 мл на 1 г носителя и связыванием липазы с полученным носителем. При этом получается препарат иммобилизованной липазы с удельной активностью 42- 48 ед, что в 2 раза превышает активность препарата, полученного известным способом, Иммобилизованная липаза может быть использована для гидролиза природных липидов с целью получения ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот. 1 табл. Недостудельная актед. на 1 гность (вре500 С),Наиболтехническоности и досфекту явллипазы на изованиемсшивающегизвестномугоссиполом проводят при 45-80 С и рН 8,0- 9,5 в течение 1 - 5 ч, а связывание фермента с носителем осуществляют при 0-16 С 2). Однако известный способ характеризуется недостаточно высокой активностью и термостабильностью получаемого продукта, Достигаемая удельная активность 14 ед,/гносителя (субстрат-хлопковое масло), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составляет 0,175, 10а время полуинактивации при 50 С составляет 3,5 ч.Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.Согласно способу получения иммобилизованной липазы, предусматривающему обработку пол иамидного носителябифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы в нейтральной или слабощелочной среде, и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального 55 реагента используют 2,4-толуолдиизоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, апосле обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20 - 30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.Использование предлагаемого способа позволяет увеличить удельную активность целевого продукта в 3,0-3,4 раза (от 14 до 42-48 ед,/мг носителя).П р и м е р 1. 1 г порошкообразного полиамида обрабатывают 4 н. НО (100 мл) при 40 С в течение 2 ч, затем промывают трижды бидистиллированной водой (по 500 мл), Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин). Затем суспендируют в 10 мл диоксана и прибавляют 1 мг 2,4-толуолдиизоцианата, 3 капли триэтиламина. и смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 20 - 25 С, затем полиамид отфильтровывают, промывают на фильтре диоксаном и смешивают с 20 мл суспензии пальмитиновой кислоты в диоксане, прибавляют несколько капель триэтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 5 ч при 80 С, Носитель промывают суспензиейпальмитиновой кислоты, ацетоном (Зх 100 мл) и.0,005 М фосфатным буфером (рН 7,8) до полного исчезновения ацетона.Для присоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному носителю к его суспензии в 0,005 М 30 35 40 45 50 фосфэтном буфере (рН 7,8) добавляют 20 мл раствора липаэы с концентрацией белка 4 мг/мл и инкубируют в течение 6 ч при 40 С. Полученный целевой продукт промывают 0,1 М фосфатным буфером и активность фермента измеряют по его способности расщеплять хлопковое или оливковое масло. Удельная активность препарата 42,0 ед,/г носителя,П р и м е р 2, 8 се операции проводят по примеру 1, но используют 25 мл пэльмитиновой кислоты. Удельная активность 48,0 ед./г носителя.П р и м е р ы 3-7. Способ осуществляют по примеру 1, варьируя количеством добавленной пальмитиновой кислоты (1 - 3,7 мл) или 2,4-толуол-диизоцианата (4-6 мл).Данные исследования приведены в таблице,Из данных таблицы следует, что полржительный эффект дбстигается при добавлении 20-30 мл пальмитиновой кислоты, Понижение концентрации пальтиминовой кислоты приводит к снижению активности целевого проудкта, а повышение ее концентрации нецелесообразно из-эа увеличения расхода реагента без влияния на активность, Оптимальные концентрации бифункционального реагента 1-2 мг на 1 г носителя.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить удельную активность целевого продукта с 14 до 42-48 ед./г носителя (т,е, в 3,0 - 3,4 раза), а также несколько увеличить стабильность иммобилизованной липазы (время полуинактивациипри 50 С возрастает с 3,5 до 6,0 ч). фа рмул а из об р ете н и я Способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липаэы с модифицированным носителем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислоты, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.1696475 Способ иммобилизации Сшивающий щеа" гент Количестево реагента, мг/г Предлагаемый 1 42,0 2;4 еТолуоледиеизоцЪанатТо же 6,0 20 е 1 11,Известный Госсипол Составитель В. МуронецТехред М.Моргентал КорректорМ, Демчик Редактор И. Дербак Заказ 4276 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 2 3 4 5 6 7 1 1 0,5 2 3 1 ее еееКоличествопаЛьмитиноевой кисло-.ты, мл 25 30 25 25 25 18 ее