Способ получения ковалентно связанной с носителем пенициллинацилазы

ОП И ИЗОЬ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 1) 446971 К. К Государстеенный комете Совета Мнннстрое ССС оо делам нэооретеннй н открытий.Дата опублик остранвцФриц Хюпвр (ФР 1) Авторизобретен Иностранная фирма) Заявнтел ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОВАЛ С НОСИТЕЕБМ ПИПИ(54 лучвнияв воде ферна носитеания с нимнициллинааанной с по, малеиноленбисакИаобретение относится к спосо: бу получения нерастворимой в воде пвнициллинацилазы, ковалвнтно свяаанной с носителем в виде слабо сшитого смешанного полимери аата акриламида, малеиновой кисло ты. и М,й-метиленбисакриламида. Изобретение мохвт найти применение для ферментативного получения 6-аминопенициллановой кислоты иа . пенициллинов.Известно применение для получе ния 6-аминопенициллановой кислоты пенициллинааы, фиксированной на носителе в виде линейного полимера,ангидрида этиленмалеиновой кислоты ЕМА - смола). Этот полимер является, однако, очень неоднородным и после гидролиза группы ангидрида карбоновой кислоты при нейтральном или щелочном значении рН растворим в воде . Этот полимер только в реаультате свяаи с ферментом и другими, свяаанныии как сомономвры в нескольких местах ди-или полиаминами обрааувт поперечныв свяаи и вследствие этого становится растворив мым в воде. Ниэкомолвкулярные ичастично растворимые в воде фракции не могут быть разделены. Поэтому свяаанный протеин теряется как растворимый материал. Кроме того ЕМА - смола вследствие болев высоких концентрациИ протеина обрааует так сильно поперечные связи, что она окааывается лишь частично доступной для субстрата.5 Предлохен способ инового нерастворимого мента, фиксированного ле посредством обраао ковалентных свяаеЫ: п цилазы, ковалентно св лимериаатом акриламид вой кислоты и М,й-мети за пиламида.(Е) является активностью . которая при этих условиях в 1 мин расщепляет 1 миоль бенаилпвнициллина в 6-аминопенициллановую и фенилуксусную кислоту и приэтом употребяет 1 имоль раствора едкого натра.Пример 1. Получение смешанного полимериаата.Полимериаат 1, 450 г акридшида, 22,5 г й,й-метиленбисакриламида и 150 г малеиновой кислоты Растворяют в 3500 мл 0,05 М фос-атного оурвра со аначениви рН6 в точке ааота, раабавляют150 мл 5 ного водного растворанитрила ропионовой кислоты и150 мл 5 Я-ного раствора перекисисульфата аммония. Реационную сиесь нагревают до 80 С аатвмвыдерхивают в течение 15 ч прикоинатной температуре и продавливают череа сито с величинойотверстий 0,5 им. После тщательного промывания водой полимериаат высушивают выморахиванием ипри давлении 20 ии рт.ст. в те-чене 2 ч нагревают в вакууме до180 С.Аналогично могут быть получены сиешанныв полииериааты следующего состав, г:П Ш 1 У УАкрилаиид 450 450 450 450й,й -Метиленбисакриламид 30 45 45 135 Малвиноваякислота 150 150 75 150Полииериааты обрабатывают далее, как укааано в примере 1.Пример 2. Пенициллинацилааана носителеА. 1.0 г пенициллинацилааы с удельйой 4 ерментной активностью 15 Е/мг растворяют в 200 мл 0,01 М буфера со аначением рН 5,8 йри 4 оС при первмешивании в течение 5 ч, добавляют маленькими доаами 15 г смешанного полимериаата, полученного по примеру 1. Значение рН поддврхивают 5,8 раабавленным аОН, По истечении 24 ч50 55 6 1 о 15 20 25 зо 35 40 ботфильтровывают при 4"С и промывают 300 мл волн. Сыпой Фепмент наносжтеле "(300 г, набухший) имеетдельную-активность о,ыэ тамг; -ыход ковалентно свяаанной пенициллинацилаан составляет 98.Аналогично осуществляется вааимодвйствие смешанных нолимериаатов.Б. 15 г. Смешанного полимериаата П подвергают взаимодействию с1 г пенициллинацилаан (15 Е/мг);выход 290 г сырого фермента наносителе с активностью 0,044 Е/мг.Выход ковалентно свяаанной пенициллинацилааы составляет 3,В, 15 г Смешанного полимериаатаШ подвергают вааимодействию с 1 гпенициллинацилаан (15 Е/мг);выход 295 г сырого фермента наносителе с активностью 0,039 Е/мг.Выход ковалентно свяаанной пенициллинацилааы составляет 74.Г, 15 г Смешанного полимериаата1 У подвергают вааииодействию с 1 гпенициллинацилаан (1 Ь Е/иг); выход280 г сырого фермента на носителес активностью О, 041 Е/мг. Выходковалвнтно свяаанной пенициллинацилааы составляет 76,5 ФД. 15 г Смешанного полиивриаатаУ подвергают вааимодействию с 1 гпенициллинацилааы (15 Е/иг);выход65 сырого фермента на носителе сактивностью 0,146 Е/мг. Выходковалентно связанной пенициллинацилааы составляет 6 Ю,ПРЕДМЕТ ИЗОДЕТЕНИЯ Способ получения ковалентно свяаанной с носителем пвнициллинацилааы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что смешанный полииериаат иа акойлаиида, иалеиновой кислоты и 1,й -метйленбисакрилаиида нагревают в вакууме и полученный ангидрид вводят в реакцию с водныи раствором пенициллинацилааы в течение нескольих часов при температуре нихв 20 С и при аначении рН 5,и,5.