Способ очистки l-аспарагиназы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советский Социалистицеских Республик(51) М. Кл 818995 28-13 72 (21) 2) Заявлено 07.0 изаяв с пр инеи Государственный камитет Соввта Министров СССР па делам изааретении и открытий(71) Заявитель В, М, Денисов, В, И, Максимов и Г, А. Мо Всесоюзный научно-исследовательский инбиосинтеза белковых веществ ова АСПАРАГИ НАЗЪ 1 Обнаружено, что в присутствии сульфата аммония 1.-аспарагиназа в экстракте из ацетонового порошка клеток Е. со 11, подкислением до рН 4,5, выдерживает без существенной инактивации нагревание до 55 С в течение 15 - 60 мин, в то время как часть балластных белковых примесей денатурирует, становится нерастворимой и выпадает в осадок, который может быть отделен от раствора Е-аспарагиназы центрифугированием. Таким образом, сульфат аммония является стабилизатором 1,-аспарагпназы, так как без него фермент при этой обработке полностью ин акти вирустся,Предлагаемый способ заключается в том, что биомассу Е. со 11, полученную выращиванием на среде, содержащей белковый гидролизат или кукурузный экстракт, глицерин и минеральные соли, при 37 С обрабатывают ацетоном, сушат и получают ацетоновый порошок Е. со 11, из которого водной экстракцией извлекают фермент. Ферментный экстракт подкисляют добавлением СН,СООН до рН 4,0 - 4,5 и отделяют от биомассы любым способом, например центрифугированием, К супернатанту, представляющему собой раствор Е-аспарагиназы с примесями, добавляют сульфат аммония до 40 - 50 ц, насыщения, смесь нагревают до 55 С в течение 15 - 60 мин (предпочтительно 30 мин), выпавший осадок денатурированных белков отделяют любым 54) СПОСОБ ОЧИСТКИ Изобретение относится к ферментной области микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментов из микроорганизмов. Оно решает задачу очистки ферментов, в частности 1.-аспарагиназы.Известен способ очистки 1,-аспарагиназы, предусматривающий приготовление экстракта, добавление стабилизатора, нагревание полученной смеси, удаление выпавших в осадок балластных белков, например, центрифугированием, и фракционное осаждение Е-аспарагиназы, например, сульфатом аммония. В качестве стабилизирующих добавок, применяемых при очистке Ь-аспарагиназы в известных способах используют глицин, алании или субстратаспарагин, а также полиэтиленгликоль. Этот способ характеризуется низкой степенью очистки аспарагиназы, при проведении которой в качестве стабилизатора используется вещество сложного состава (1,-аспарагин); расход этого вещества особенно велик на первых стадиях очистки, где применяют большие объемы жидкости.Для повышения стабильности Е-аспарагиназы предлагается в процессе очистки перед добавлением стабилизатора экстракт подкислять, а в качестве стабилизатора использовать сульфат аммония, Целесообразно экстракт подкислять до значения рН 4,0 - 4,5, например, добавлением уксусной кислоты. и 1 436085Таблица Удельная Выход С- активность, аспарагиназы,МЕ/мг белка Условия обработки экстракта Исходный раствор (рН 4,5)Нагревание без сульфата аммония (55 С; 30 мин)фракционирование сульфатом аммония (50 - 90% полногонасыщения) без нагреванияПовторное фракционирование (50 - 90, полного насыщения)с нагреванием (55 С; 30 мин)Одностадийное фракционирование сульфатом аммония70 - 80 15,0 15,0 70 40 45 способом (фильтрованием или центрифугированием). Получают раствор Е-аспарагиназы в полунасыщенном растворе сульфата аммония, очищенный от значительной части балластных белков. Для извлечения из него 1,-аспарагиназы добавляют сульфат аммония почти до полного насыщения (90 - 100%).Предложенным способом получают .-аспарагиназу с удельной активностью 15 - 25 МЕ/мг с выходом 70 - 80% подкисленного экстракта.Для определения удельной активности Е-аспарагиназы, после очистки ее нагреванием в полунасыщенном растворе сульфата аммония и осаждения ее из раствора, насыщенного той же солью, вещество предварительно очищают от примеси сульфата аммония хроматографией через гель сефадекс 6-25. ПоП р и м е р 1. 5 г ацетонового порошка Е. со 11 смешивали со 100 мл воды и нагревали при 37 С 2 час периодически перемешивая, добавляли 6 мл 1,0 М СН,СООН. Осадок отделяли центр ифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, К 90 мл супернатанта с удельной активностью 3,0 МЕ/мг при постоянном перемешивании добавляли 28,8 г кристаллического сульфата аммония (50% насыщения). Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. К супернатанту при постоянном перемешивании добавляли 34,2 г кристаллического сульфата аммония (100% насыщения), Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 10 мл воды. К 10 мл полученного раствора при постоянном перемешивании добавляли 3,2 г сульфата аммония. Раствор ставили в водяную баню при 55 С и выдерживали 30 мин, осадок отделяли центрифугированием. К супернатанту добавляли 3,8 г сульфата аммония. Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 10 мл воды.Раствор имел удельную активность 15 МЕ/мг.П р и м е р 2. 50 г ацетонового порошка Е. со 11 смешивали с 1 л воды, нагревали до 20 25 30 35 лучают удельную активность 5 МЕ/мг белка с выходом 70% содержания 1,-аспарагиназы в исходном экстракте, Активность измеряют по количеству аммиака, освобождающегося при ферментативном гидролизе 1,-аспарагина и определяемого несслеризацией. За единицу активности берут количество фермента, которое приводит к образованию 1 микро- моля аммиака за 1 мин при 37 С (международная единица) . Активность определяют в натрий-ацетатном буфере рН 5,0. Белок определяют обычными методами: по Лоури и биуретовым. В таблице приведены средние результаты, характеризующие влияние нагревания растворов т.-аспарагиназы на удельную активность и стабильность. 37 С в течение 2 час периодически перемешивая. После этого к раствору добавляли концентрированную уксусную кислоту до рН 4,5, Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. К 0,84 л супернатанта с удельной активностью 6,0 МЕ/мг белка при постоянном перемешивании добавляли 269 г кристаллического сульфата аммония (50% насыщения), раствор нагревали до 55 С в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и фильтро- вали через бумажный фильтр. К раствору (0,95 л) при постоянном перемешивании добавляли 285 г кристаллического сульфата аммония (90% насыщения). Осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин и растворяли в подходящем буфере.Удельная активность полученного раствора 26,3 МЕ/мг, выход 75%,Предмет изобретения 1. Способ очистки 1,-аспарагиназы, предусматривающий приготовление экстракта, добавление стабилизатора, нагревание получен. ной смеси, удаление выпавших в осадок бал.436085 Составитель В. Максимов Техред Е, Борисова Корректор А. Дзесова Редактор Л, Тюрина Заказ 3322/7 Изд.1814 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 ластных белков, например, центрифугированием, и фракционное осаждение /.-аспарагиназы, например, сульфатом аммония, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности Е,-аспарагиназы, в процессе очистки перед добавлением стабилизатора экстракт подкисляют, а в качестве стабилизатора используют сульфат аммония.2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи й с я тем,что экстракт подкисляют до значения рН 5 4,0 - 4,5, например, добавлением уксуснойкислоты.