Способ выделения лейцинаминопептидазы из aspergillus oryzae

. Путере и И.А. Вин 71) Заввятевь 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙЦИНАИИНОПЕПТИДА ИЗ А 5 РЕВ 6 ЫО 5 ОКУХАЕносится к способама лейцинаминопепти",1.), применяемой вогни для исследовай последовательнос"екулах, для получе"в медицине,обы получения лейцинживотного и расти"апример, из почки .емян гороха2 1.собы основаны на ис.итного или пищепромышленного з вогоначепо техническойпособ полученияы с помощью микроости из плесневогоГУЙЙ 13ся в том," раствор ои аиб близким ляется с пептидаз в части О 11 цз о сущности ялейцинамин/организмовгриба Азре что не предва Способ заключаеточищенный Мрментни Изобретение ополучения фермендаэы (1:.Ф,3.4.11молекулярной биолния аминокислотноти в белковых молния аминокислот1 эвестны спосаминопептиэады ительного сырья,свиньи1и иэОднако эти сппользовании дефисырья и не имеютния. тельно очищают групповой обработкойамберлитом, фракционируют сульфатом аммония, осаждают риванолом.Получейный осадок двухкратно экстрагируют 0,5ацетатнымбуфером с рН 5,0. В 5 ьхлажденном экстракте осаждают белки,добавляя охлажденный ацетон до 67- ной концентрации. Осадок растворяют в воде. Последующую ионообменную хроматографию на ДЗАЭ-целлюлозе проводят опри линейном гриденте 0"0,4 И йаСф в 0,01 И оосфатном буфере с рН 7,0.После концентрирования на ультраильт ре лейцинаминопептидазную оракцию наносят на колонку с сефадексом 0-100 зи повторно гельфильтруют на колонке с сефадексом 0-200 в 0,1 И ацетатном бункере с рИ 6,5. Потом проводят хроматографию на диэтиламиноэтил"сефа" о дексе Ас Фоспатным бумром (рН7,0) при линейном градиенте 0-0,4 И МаС. Очистку завершают повторной гельфильтрацией на себадексе 0"200 в 0.1 М ацетатном бупере с рН 6,.3Полученный препарат замораживают до5 ОГОбщая активность лейцинаминопептидаэы (в экстракте - 2090 ед., в полученном препарате " 262 ед.) - 131.Удельная активность лейцинамино" пептидазы в экстракте - 0,181 ед./мг белка, в полученном препарате- М,54 ед./мг белка (субстрат трипептид Пей-Гли-Гли). Вычисленная сте- о пень очистки - 25.Наряду с обеспечением высокой удельной активности известный способ имеет недостатки - сравнительно ниэ" кий выход по общей активности, вызван 1 з ,ный длительным и многоступенчатым процессом выделения, в котором возни. кают потери, и недостаточно высокую степень очигтки,аЦель изобретения - повышение вы"хода и степени очистки, упрощениепроцесса выделения.Поставленная цель достигается способом получения лейцинаминопептидаэыиз Лэрегц 111 цэ огугае,включающим экстракцию Фермента буфером, осаждениеего органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией буфером,содержащим йаС 1, причем в качествеорганического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-673, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят дважды, при этом сорбцию Фермента проводят в статическихусловиях при объемном соотношении Фермент:сорбент 1:(1,3-1,5), элюцию Фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентоМ йаСот 0,2 до 0,5 М в буфере, а между хро 46матографическими стадиями Ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62 С в течение 1012 мин.Обычно используют 0,005 И веро-,нальный буйер с рН 7,9-8,0,Этим достигается повышение качества сорбции Фермента на ионообменнойцеллюлозе, которую осуществляют смешиванием Ферментного раствора с сорбентом в статических условиях, Про.ведением десорбции Фермента в динамических условиях при ступенчатом градиенте достигается четкость разделе"ния белков. Отличия в условиях сорб- ффции и десорбции сокращают время проведения стадий ионообменной хроматогра-фии и рехроматограйии, Увеличение 4степени очистки на этих стадиях пот зволяет отказаться от гельфильтрации на сефадексе и упростить процесс.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Амилориэин П 10 Х экстрагируют 3 ч 0,005 М верональным буфером с рН 7 9 при комнатной температуре. Центрифугируют 25-35 мин при 5500-6000 об/ /мин. Центрифугат охлаждают и добавляют охлажденный до -20 С этиловый спирт до конечной концентрации 60-671. Через 20 мин .осадок отделяют центриФугированием, которое осуществляют 20-2. мин при 5500-6000 об/мин и 0-1 фС, и растворяют в двоййом объеме 0,005 М веронального буфера с рН 7,9" 8,1. Нерастворенный осадок отделяют центрифугированием при тех же услови" ях, Полученный центрифугат смешивают с уравновешенной бупером ДЭАЭ-цел" люлозой в объемных соотношениях 1:( 1,3-1,Я и заполняют колонку. Неорбированные белки и лейцинаминопепидазнонеактивные белки отмывают 0,2 М раствором МаГ в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют 0,5 И раствором ЦаС 1 в том же бупере, диализируют и нагревают до 60-62 Г, выдерживаютОпри этой температуре 10-12 мин, быстро охлаждают до ОС, смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3-1,5) и заполняют в колонку, Отмывание колонки и десорбцию фермента проводят как и первую хроматографию. Полученный препарат концентрируют с сухим сефадексом Г 1-75,Выход по активности - 253 (активность в экстракте - 8,68 ед в полученном препарате " 2,17 ед.).Степень очистки - 38 (удельная активность экстракта - 0,00815, полу" ценного препарата - 0,31 ед/мг белка по субстрату Лей-й-нитроанилид).П р и м е р 1. 50 г амилориэина П 10 Х экстрагируют в 250 мп 0,005 М верональном буфере с рН 7,9-8, в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют 25-35 мин при 5;5- 6,0 тыс.об/мин.Экстракт (215 мл) охлаждают до0-4 С и добавляют 502 мл 961-ного этилового спирта, охлажденного до -20 С, до конечной концентрации 67 Через 20 мин осадок отделяют центри9757Фугированием при 5,5-6,0 тыс.об/минпри(-21 -2) С и растворяет в 10 Р мл0005 М веронального буФера с рН 7,98,1, Нерастворимый осадок отделяютцентрифугированием при тех же усло"виях.Полученные 135 мл центрийугата смешивают в течение часа с 175 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой(в объемных соотношениях 1:1,3) и за" фполняет в хроматографическую колонку.Несорбированные и балластные белкиотмывают двумя литрами 0,2 Н раствора ИаС 1 в 0,005 Н верональном буфе"ре с рН 7,9-8,1. Активную Фракцию одесорбируют, пропуская через колонку 1 л 0,5 Н раствора МаС 1 в том жебуфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазнойактивности), следующие 320 мл, содер- зфжащие максимально активный Ферментрсобирают и диалиэируют против 5 л0,0005 Н неронального буфера с рН 7,98,1 в течение 24 ч. Во время диализа буферныйраствор меняют 4 раза. ИДиализированный раствор нагреваютдо 60"62 С и выдерживают при этой температуре 10 мин, потом быстро охлаж" дают до 2-6 оС,Инактивированнце протеиназы отде" зфляют с помощью рехроматографии наионообменной целлюлозе. Диализированный рариантный раствор сиаюивают в трчение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:1,3 и заполняют в хроматогра" фическую колонку. Несорбированце белки отмывают двуня литрами 0,2 Н раствора аС 1 в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную Фракцию десорбируют одним литром 0,5 И раствора ИаС 1 в том же буФере. Первые 20 мл элюата выбрасывает (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следую" щие 320 мл, содержащие максимальноактивный Фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 М верональн 9 го ,буфера с рН 7,9-8,1 в течение 24 ч.1Во время диализа буферный раствор меняют 4 раза. С целью концентрирования в 350 мл диализированного Ферментного раствора помещают целлоФановый мешочек с 40 г сухого сефадекса 0-75. Через 24 ч к 5 мл концентрированного Ферментного раствора прибавляют 2,36 г сухого сульфата аммония (до 393 от 0,7 насыщения) и 0,0012 хлористого магния,97Общий выход по активности полученного препарата - 254 (активность экст. ракта - 8,84 вд полученного препарата -,2,21 ед,), Степень очистки 32 (удельная активность экстракта 0,0079, полученного препарата 0,25 ед./мг белка по субстрату Лей"-ю -нитроанилид).П р и м е р 2. 5 Р г амилоризинвП 1 О Х экстрагируют в 250 мл 0,005 Иверональном буфере с рН 7 9-8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре.Центрифугируют, осаждают белки спиртом, центрифугируют, растворяют осадок и вновь центрифугируют, как в при.- мере 1.Полученные 130 мл центрифугата смешивает в течение часа с 195 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой ( в объемных соотношениях 1:1 р 5) и эапол" няет хроматографическую колонку. Несорбированнце и балластные белки от"мцнают двумя литрами Ор 2 Н раствора ЙаС 1 в 0,005 М верональном буфере срН 7,9-8,1, Активную Ферментную Фракцию десорбируют, пропуская чЕрез ко" лонку 1 л 0,4 Н раствора ЙаС в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбра"сцвают 1 не имеют лейцинаминопептидаэной активности , следующие 340 мл, содержащие максимально активный Фермент, собирают. Диализ и тепловую обработку проводят аналогично первому примеру.При рехроматографии диализирован" ный Ферментный раствор смешивают в те" чение часа с уравновешенной буфером ДЭЛЭ-целлюлозой ( в объемных соотно" шениях 1:1,5) и заполняют хроматограФическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя лит" рами 0,2 Н раствора ФаС 1 в 0,005 М верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную Фракцию десорбируют одним литром Ор 4 М раствором НаС 1 в том же бу.Фере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной ак" тивности), следующие 330 мл, содержащие максимально активный Ферментр собирают. Диализ и концентрирование конечного продукта проводят аналогично первому примеру. Общий выход по активности полученного продукта - 253. (акти вност ь э кстракта - 8,91 ед., полученного препарата " 2,23 ед.). Степень очистки - 34 (удельная активность экстракта,0093, полученного препарата975797 70,30 ед./мг белка по субстрату Лей" -11-нитроанилид).П р и м е р 3. Экстракцию и осаж" дение белков этанолом проводят аналогично первому примеру, При ионообмен-ной хроматографии 130 мп Фврментного раствора смешивают в течение часа с 180 мл уравновешенной буФером ДЭАЭ" целлюлозой ( в объемных соотношениях Ч:1,1) и заполняют хроматографичес- е кую колонку. Несорбированные и бал" ластные белки отмывают двумя литре" ми 0,3 И раствора йаС 1 в 0,005 И веро. нальном буфере с рН 7,9-8,1, фермент" ную Фракцию десорбируют, пропуская 1 ф через колонкул 0,1 И раствора ЙаС 1, в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинамино" пептидазной активности), следующие 330 мл элюата, содержащие максималь" ЗЕ но активный ориент, собирают. Диализ и термоинактивацию балластных белков проводят аналогично первому примеру. При рехроматограбии диализированный Ферментный раствор смешивают в тече" фф ние часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,4), заполняют колонку, отмывают 0,3 И раствором МаС в 0,005 И верональном буФере с рН 7 9"8, и де- за сорбируют 0,1 Н раствором ИаС 1 в том же буФере. Собирают 330 мл (с 31-го по 360"ый мп) элюата, содержащих мак" симально активный Фермент. Конечный продукт получают после диализа и кон" ЗЗ центрирования.Общий выход по активности конец" ного про)1 укта - 253 (активность экстракта - 8,77 ед., полученного препарата " 2,79 ед;), Степень очистки - 46 38 (удельная активность экстракта,00815, полученного препарата,31 ед./мг белка по субстрату Лей+-нитроанилид). Определение активности Фермента.За единицу активности лейцинамино пептидазы принимают такое количество Фермента, которов гидролизует 1,0 мкмоль лейцин-И-нитроанилида в минуту при 37 ОС и рН 8,5.Удельную активность лейцинамино" пептидазц, вычисляют по Формуле А щ т в3 -- ед,/нг белка,24 юоЗ 5 . и 3,9 с 0,1х где 3,5 -. объем реакционной смеси в кювете, сиф;83,9 " коэфФициент экстинкции1 мкмоль И-нитроанилина вусловиях опыта;й - время инкубации Фермента ссубстратом;0,1 " объем раствора препарата,взятый на анализ, смз;х " концентрация белка в исход"ном растворе, мг/смЗ (определяется по Лоури).Активность лейцииаминопептидазы определена на субстрате Лей-И"нитро" анилид отечественного производства.Технико-экономический эФФект изобретения заключается в обеспечении производства Фермента лейцинаминопептидазы, используемого в молекулярной биологии и медицине из дешевого микро" биального сырья; повышение общего выхода по активности, который по изеест" ному способу составляет 13, а по предлагаемому " 253, Кроме того, степень очистки увеличивается с 25 (по известному способу),до 38 (по предла" гаемому). В процессе выделения исключаются также стадии гельфильтрации на свфадексе 6-100 и сефадексе 0"200. Формула изобретения 1. Способ выделения лейцинаминопептидазы из Азрегц 11 цз огугав путем экстракции Фермента буфером, осаждения его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцивй буфером, содержащим МаС 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода, по активности и степени очистки Фермента, а также упрощения процесса, в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-67, хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды, причем сорбцию фермента проводят в статических условиях при объемном соотношении Фермент : сорбент 1:1 1,3-1,5), элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом ИаС от 0,2 до 0,5 И в буФере а между хроматограйическими стадиями Фермент- содержащий раствор подвергают термообработке при 60-62 оС в течение 10- 12 мин.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем, что используют 10,005 И верональный буфер с р 1 7,9-8,.975797 сточники инйормации,принятые во внимание при вкспертизе 1. брасснап О, 5 гС Е.Ргвчп 0.0. .ецспе ачпорерйЬазе ч, Овоайоп апд ргорегйез оЮ йЬе епдч,ее Угол зипе В фпеу. Во 1, реп 199, чо 1. 212, йг. 1, р, 255.; О2. Е 11 егщп Т,1:. ЛпопорерсЬаве Иреа. ВосЬю. 4 197 Ь, Уо 1. 11, Мг. 1, р. 113-18.3, яМада Т йаенпо 5., цосим Ч. у Р 0 гсайоп о 1 ецспе ащопорерФЬаьеггоо Лер, огузове, Атг. Во 1.СЬен 1973, Уо 1. 37, Иг, , р, 767- 77.Составитель О. СкородумоваРе 8 актор П Егорова ТехрелИ,Гергель КовоекторА, ГриценкоЗаказ 5931/13 Тираж 505. Подпи сноеВНП 1 Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий11 ОД Носква И-Б Рал 0 ская наб. 8. ДФилиал ППП ППатентд, г. Ужгород, ул. Проектная, 51