Способ получения нерастворимыхкомплексов протеолитических фер-mehtob

Союз Советских Социалистических Республик,Ч 1.,з С 07 6 7/О аявкп Лв сударственныи комитет Бюллетень Ло 9 УДК 577.15.ио делам изобретеии и открытий описания 07.03.8) Авторы изобретен 1 ирова ф, Мишунин, Ю. стен ко охи мин 4(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАСТВОРИМЫХ КОМПЛЕКСОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВЗаявитель Ордена Трудового Красног им. А. ВИзобретение относится к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов и может быть использовано в ферментной промышленности.В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности для гидролиза белковых субстратов из сырья животного и растительного происхождения.Обычно в технологических процессах ферментные препараты используются однократно, так как их растворы загрязняются продуктами реакции, после чего активный ферментный раствор становится отходом, что снижает рентабельность производства.Более перспективным является использование иммобилизованных ферментных препаратов. Однако большинство известных способов получения таких нерастворимых ферментных препаратов достаточно сложны и поэтому неприемлемы для воспроизведения их в промышленных услоьи. ях, стоимость получаемых ферментных препаратов достаточно высокая.Известен способ получения нерастворимых комплексов протеолитических ферментов (в частности трипсина), согласно которому, 2,5%-ный раствор фермента в буфере обрабатывают раствором глутароиого альдегида при концентрации последнего в реакционной смеси до 2 оо в течение нескольких часов, затем проводят осаждение фермента сульфатом аммония (степень насыщения 80 оо) при перемешиванпи ь тече ние 2 ч. Затем удаляют непрореагпровавший альдегид добавлением ХаНЯО:отделяют осадок фильтрованием, который многократно промывают 0,15 М раствором 1 чаС 1, буфером и водой и подвергаот лио 10 фильной сушке 111.Недостатком данного способа являетсяего продолжительность, наличие большого числа операций, необходимость проведения лиофилизации.15 Целью изобретения является упрощениепроцесса при сохранении высокой активности целевого продукта, а также ооеспеченис возможности внедрения способа в производство.20 Указанная цель достигается тем, что вкачестве раствора фермента используют 10%-ный водный раствор фермента, в качестве раствора альдегида - раствор формалина (при концентрации последнего в 25 смеси 2,5 - 3%), обработку ведут в течение30 - 40 мин. Осадок отделяют центрифугированием и сушат при комнатной температуре.Согласно изобретению, описывается 30 способ получения нерастворимых комплек.810721 Лдстпв ностьнсрастворпмо омсрго протсзпма,цпк:.280/па Лдстивность срастворимоо просзндиа,%/280/ад,т 1-ой ср пп.12 15 16 171820 0.720 0,710 0.710 0,730 0 695 071 1 2 3 4 о 6 0,710 0,715 0.690 0,720 0,680 0,670 0,630 0,635 0,610 0,590 1 О 0,705 0 710 0,700 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заказ 2151 Тираж 419 Из.т. 5 о 23 о Подписно; Загорская типография Упрполиграфиздата Мособписпо,тко,.з 3сов протсолцтических ферментов путем обработки 10%-ного водного ддагтвора 1 дермента раствором формалина при коццеддтрацци сго в реакционной смеси 2,5 - 3% втечение 30 - 40 миц, отделсния осадка центрифугированисм, промывания осадка водойд сушки при комнатной темддературе.Описываемый способ обеспечивает, крсмс того, возможность дополнительного издпдсчсддия целевого продукта цз промывцыхвод, полученных в результате промывкиссадка, путем их объединения посл4- - 5 промывок, упаривания в вакууме, повторной обработки формалином, цсцтрцфугирования и сушки.Описываемый способ обеспечивает получение нерастворимых комплексоь протсолитических ферментов с высокой удельнойактивностью на уровне 2 - 2,5 ед/м оелка(по Кунитцу), что составляет 60 в -70% отисходной,Получаемые ферментные гдрспаратымогут быть использованы в технологических процессах 10 - 15 раз без потс 1 п акт Вности.Пример 1, 1 кг протезцма (активность0,6500,750 сд/мг), выпускаемого опытнымпроизводством ИОХ АН УССР, растворяют в 10 л дистиллированной воды и ь раствор дооавляют 40%-цьдй формалин до концентрации 2,5",О, Раствор при перемешцвадпи ц тсмпсратурс 20 С выдерживаю г30 мпц, после чего вьшавший осадок о" деляют цснтрифугировацием при 2000 обЪцдв течение 20 миц. Осадок суспецзируют в1 О л воды и вновь цснтрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и осадок вновьпромывают водой. Эту промывку повторяют 5 раз. После пятой промывки протеолитическая активность в надосадочной жидкости отсутствуст. Промывныс воды упари.вают в вакууме до концентрации протезима, соответствующей исходному раствору,(1 кг в 10 л волы) и вновь обрабатываютформалином. Осадок ферментного препарата послс пятой промывки высушивают втоке воздуха при комнатной температуре,после чего измельчают до размера частиц0,20,5 мм в диаметрс.Полученный препарат протезима нерастворим в воде и готов для промышленного использования.Для определения протсолитцческой активности 2 мг нерастворимого протезимасуспензируют в 1 мл воды и определенияпроводят по Кунитцу. Активность полученного препарата 2 - 2,5 ед/мг белка, что составляет 60 - 70% от исходной.Ниже приведены данные, характеризующие активность препарата, полученногоданным способом при многократном его использовании. В 15 циклах активность пре 4парата составляет 0,690 - 0,720 сд/мг, чтосоответствует уровню 96 - 95% от исходнод. Пример 2. 1 кг протосубтилина Г-ЗХ (активность 0,05 - -0,06 ед/мг), выпускаемого Вильнюсским ферментным заводом, растворяют в 10 л дистиллированной воды, добавляют 3,5%-ный раствор формалина и дальнейшую обработку проводят так, как описано в примере 1,Активность полученного нерастворимого прспарата протосубтилина 2 - 2,5 ел,мг белка, что составляет 60 - 70% от исходной,Полученные ферментные препараты с высокой удельной активностью предназна. чены для гидролиза белка в растворах, представляющих собой отходы пищевой, химической и легкой промышленности. После отделения ферментного препарата, полученные белковые гидролизаты могут быть использованы в животноводстве. Формула изобретенияСпособ получения нерастворимых комплексов протеолитических ферментов, включающий обработку раствора фермента ра створом альдегида, отделеде осадка, промывку его водой и сушку, о т л и ч а до щ и йся тем, что, с целью упрощен. я проддесса при сохранении высокой активности, в качестве раствора фермента испол зуют 10%-ньдй водный раствор фермента, в ачествс раствора альдегида - раствор формалина при концентрации последнего в реакционной смеси 2,5 - 3%, обработку ведут в течение 30 - 40 мин, отделение осадка осуществляют центрифугированием, а сушку проводят при комнатной температуре.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. А. Р, Я. А. На 1 дееЬ, сРгерага 11 оп од Еддзупддса 11 у Ас 1 дуе, %а 1 егпзо 1 ц 11 е Оег 1 ча.1 дмез о Тгурздп, Агс 1 ддмез о 1 Вдос 1 депддз(гу апс 1 Вдор 1 дуздсз, 119. 1697, 264 - 268 (прототип).