Способ получения аденозинтрифосфата

(57) Изобретен гии, а точнее кс трифосфата. Ц конверсии суб Сущность иэоб форилировании жей Яассйа реакционной ср 0,55 - 0,85 М пр ляет получить версию аденоз оносоваИ.Райнина и А Синиельство СССР19/00, 1975.ельство СССР19/20, 1978,ЛУЧЕНИЯ АД ЕНОГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЗИ НТРИФОСФАТА Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способу получения аденозинтрифосфата (АТФ) с помощью клеток дрожжей рода ЯассЬаговусез, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для получения лекарственных препаратов, а также для получения реактивов для научных исследований.Известны способы получения АТФ с помощью различных микроорганизмов; пекарских дрожжей, метанольных дрожжей Сапбба Ьоби 1, бактерий Вгеч Ьас 1 егцв аввопацепез, АгйгоЬастег зресез из аденоэина или аденина в среде, содержащей неорганический фосфат, источник энергии (сахар), источники ионов калия, магния, а также реагент, изменяющий проницаемость клеточных стенок микроорганизмов, например толуол, ксилол. При этом ферментативные системы микробных клеток осущетвляют биофосфорилирование аденозина. Продуктом ферментативного превращения является смесь моно-, ди- и трифосфатов. Выход АТФ в смеси с другими ие относится к биотехнолопособу получения аденозинель - повышение степени страта в целевой продукт. ретения заключается в фосаденозина клетками дрожговусез сегеуз ае в еде с содержанием фосфата и рН 7,0-7,5. Способ позвопрактически 100 ф(-ную конина в АТФ. 2 табл. нуклеозидфосфатами не превышает 700, Выделение АТФ из реакционной смеси осуществляют с применением методов ионнообменной хроматографии.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения АТФ с помощью пивных дрожжей рода ЯассЬаговусез, согласно которому АТФ получают биофосфорилированием аденозина с помощью пивных дрожжей рода Яассйаговусез в ре Ъ акционной среде, содержащей неорганический фосфат (0,16 М), сахарозу, источники фь ионов калия и магния, толуол, подкисляя Я среду ледяной уксусной кислотой до рН 4,5 - 4,8.Недостатком известного способа является неполное фосфорилирование аденозина и получение смеси продуктов с содержанием 70 - 72АТФ и 80 АДФ.Целью изобретения является повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт,Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения АТФ, предусматривающему фосфорилирование аденозинав среде; содержащей неорганический фосфат, клетками дрожжей, используют клетки пекарских дрожжей Яассйагощусез сегензае и процесс ведут при содержании фосфата 0,55 - 0,85 М, поддерживая в реакционной среде рН 7,0 - 7,5.Способ осуществляют следующим образом.Яассйагоаусез сегечзае культивируют в известных условиях на среде, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и минеральные соли, Выращенную биомассу помещают в среду, содержащую аденозин, глюкозу, неорганический фосфат, толуол и соль магния. В этих условиях происходит полное фосфорилирование аденозина в АТФ. Оптимальными условиями для получения АТФ является концентрация неорганических фосфатов в реакционной среде 0,55 - 0,85 М и значение рН 7,0 - 7,5, При использовании концентрации неорганических фосфатов ниже 0,55 М падает выход АТФ, а увеличение содержания фосфатов выше 0,85 М нецелесообразно, так как не ведет к изменению выхода и состава продуктов, Изменение же диапазона рН выше или ниже интервала 7,0 - 7,5 приводит к снижению выхода целевого продукта,В табл.1 приведены данные, показывающие влияние концентрации фосфатов на состав получаемых продуктов фосфорилирования, В табл. 2 - данные, отражающие влияние рН реакционной среды на эффективность биотрансформации.П р и м е р 1. Культивирование ЯассЬаготусез сегечзае 14 проводили на среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: глюкоза 2,5; дрожжевой экстракт 2,0; КН 2 РО 4 1,0; йаС 1,0; МдЯ 04 х 7 Н 20 0,5; (ИН 4 ЬЯ 04 0,5; рН 6,5 в качалочных колбах объемом 750 мл (объем среды 200 мл) при температуре 30 С и скорости вращения качалки 180 об/мин. Выращенную в течение 20 ч культуру дрожжей центрифугировали 5 мин при 5 тыс. об/мин.Отделенную центрифугированием биомассу переносили в реакционную среду следующего состава: 0,6 М К-фосфатный буфер5 рН 7,2, 9,4 мМ аденозин; 0,5 М глюкоза; 20мМ МдЯО 4 х 7 Н 20; 0,3 толуол (по объему).Трансформацию проводили в колбах объемом 100 мл (объем реакционной среды 25мл) при температуре 30 С и скорости враще 10 ния качалки 200 об/мин. При этом практически весь внесенный аденозинпревращался в АТФ, примеси АМФ и АДФсоставляли менее 1 ф(степень конверсии98,5 ф). Из 2,5 г/л внесенного аденозина15 получено 5,1 г/л АТФ.Анализ продуктов биофосфорилирования проводили с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографиина хроматографе фирмы "Вогаб",20 П р и м е р 2. Культивирование дрожжей,центрифугирование биомассы, условия проведения биотрансформации такие же, как впримере 1. Но при этом варьировали концентрацию неорганического фосфата, а так 25 же использовали различные штаммыдрожжей,П р и м е р 3, Культивирование дрожжей,центрифугирование биомассы, условия проведения трансформации такие же, как в при 30 мере 1, но варьировали исходное значениерН реакционной среды,Формула изобретения Способ получения аденозинтрифосфата 35 путем фосфорилирования аденозина клетками дрожжей в среде, содержащей неорганический фосфат, сахар, соль магния и толуол, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени конверсии субстрата в 40 целевой продукт, используют клетки дрожжей ЯассЬаговусез сегечзае и фосфорилирование проводят при исходной концентрации неорганического фосфата в среде 0,55 - 0,85.М и рН 7,0 - 7,5.1740420 Таблица 1 щКонцентрацияфосфатногобуфера Название штамма Степень био- Количества образовавфосфорилиро" шейся нунлеозидфос" ванин адено- фатовзинаЧ БассЬагощусезсегевгзгае 985 0,55 М АТФ - 9,28 мн(ДДФ Днф) (0,1 мндтф - 4,3 мнддф - 2,3 мнЯНФ - 2,5 мМ То ме 9862 0,85 М 9852 1,0 М 0,4 Н 98,Ц 983 0,3 М АТФ - 3,0 мМ ддф - 3,0 мн Янф - 3,1 мн 0,2 М 982 АТФ " АДФАМФ " 1,0 мн 3,5 мн 4,7 мМ 0,25 мМ 2,8 мМ 6,2 мн 0,15 М 982 АТФ " ЯДФ- Анф 982 0;1 М АТФ СО 2 мМАДФ - 2,6 мМАнф - 6,4 мМЯТФ - 9,25 мн(ддф+дНф), ц 0,1 мн 0,6 М БассЬагошусеасегет зз(аераса А(ВКМ 373) 98,48 0,15 М 98 ь То ве ДТФ " 0,2 мнАДФ - 2,9 мндмф " 6,15 нн Таблица 2 Составитель Н.Симанова Редактор Т,Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор О.КравцоваПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 2051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5