Способ выделения глутамина

(51)5 С 12 Р 13 14 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЕТЕЛЬСТ ВТОРС КОМУ НА при в пиости. жидкийприни со ова, мин лонх 8 в элю атем чно- истоглутае, утв. гизп(56) Патент ФранцииМ 1470219, кл. С 12 Р 13/14, 1965.Заявка ЯпонииМ 49-18828, кл. С 12 Р 13/14, 1982.Регламент на способ выделениямина на Бердском химическом завод05,08,88. Изобретение относится к биотехнолои и касается получения глутамина, испольуемого в пищевой и медицинской ромышленности, конкретно выделения его из культуральной жидкости.Известен способ ионообменного выделения глутамина, заключающийся в том, что культуральную жидкость подкисляют НС до рН 3,5 и фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с сильнокислотным катионитом для сорбции глутамина, последний элюируют слабым раствором аммиака, который отпаривают под вакуумом; раствор концентрируют при дальнейшем упаривании, очищают углем и дважды кристаллизуют из спирта.Недостатки этого способа состоят в том, что будучи неустойчивым в кислой среде.глутамин частично разлагается в процессе сорбции, так как рН в фазе сильнокислотного катиона достигает 0,5 - 0,7, Упаривание рас(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛУТАМИ (57) Использование: в биотехнологии получении глутамина, применяемого щевой и медицинской промышленн Сущность изобретения: культуральную кость нейтрализуют при перемешив фосфорной кислотой и фильтруют. Об ленный фильтрат пропускают через ко ку, заполненную катионитом КУ 2 Н -форме, Отсорбированный глутамин ируют с колонки раствором щелочи и з выделяют его кристаллизацией из щело го элюата. Выход продукта 75 - 80;, ч та не менее 98,50. твора также приводит к частичному разложению глутамина. В результате перечисленных факторов в процессе очистки теряют 30 - 40 препарата,Известен способ выделения глутамината из растворов, состоящий в том, что раствор глутамина очищают от неорганических солей в электродиализаторе при рН 5,5 - 5,6 и затем кристалл изуют.Однако электродиализ не освобождает глутамин от органических и пигментных примесей культуральной жидкости, которые препятствуют кристаллизации. Поэтому данный метод не может самостоятельно быть использован в качестве промышленного способа производства глутамина,Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от приме 1740419сей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта.Основной недостаток способа состоит в многостадийности процесса и больших потерях целевого продукта вследствие разложения в процессе сорбции на катионите и вы парки,Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения глутамина, предусматривающему ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культу- ральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2 х 8 в Н+- форме и элюируют его раствором щелочи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.Сущность предложенного способа состоит в следующем.Культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой до рН 5,5 - 6. При этом суспензия расслаивается и ее фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с катионитом в Н -форме и глутамин сорбируется вместе с посторонними катионами. Затем через колонну пропускают 2,5 - 3,5;-ный аммиак и получают элюат глутамина, не содержащий солей. Аммиак отпаривают под вакуумом. Нативный раствор можно обессолить другим методом - пропуская его с высокой скоростью через ряд последовательно соединенных пар: катионит Ку 2 х 20 в Н -форме и анионит ЭДЕ п в ОН форме, В этом случае происходит и частичное осветление нативного раствора. Расход смолы в обоих вариантах обессоливания почти одинаков, Обессоленный раствор пропускают через осветляющую колонну с ионитом ИАи затем через колонну с катионитом Ку 2 х 8 в Н -форме, который полностью насыщается глутамином, Последний элюируют 1 - 2 н.щелочью, причем рН элюата держится на уровне 5,6 - 6,0, что соответствует изоэлектрической точке глутамина. Поскольку концентрация глутамина в элюате превышает в 6 - 8 раз его растворимость, а раствор не содержит посторонних примесей, начинается кристаллизация, Выпавшие белые иглообразные кристаллы центрифугируют до влажности 18 - 20, Чистота продукта не менее 98,5. Конец сбора глутамина при элюции - бедную фракцию вместе с маточником присоединя 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ют к обессоленному раствору перед осветлением. Общий выход продукта 75 - 80.П р и м е р 1. 5 л культуральной жидкости с концентрацией глутамина 38 г/л заливают в емкость с мешалкой и постепенно вводят концентрированную фосфорную кислоту (55 мл) до рН 6,0, В результате суспензия расслаивается за счет превращения мела в фосфат кальция. Суспензию фильтруют на нутч-фильтре и промывают осадок 200 мл воды. Получают 320 г осадка влажностью 62 и 4,9 л фильтрата с концентрацией глутамина 35 г/л и содержанием посторонних катионов 700 мг-экв/л. Для обессоливания используют систему последовательно соединенных стеклянных колонн емкостью 10 мл каждая. Соединялись последовательно пары: катионит Ку 2 х 20 в Н -фрме - анионит ЭДЕи в ОН - форме, Скорость раствора в системе 5,0 л/ч. Глутамин не сорбируется на смоле Ку 2 х 20 и, учитывая малое время контакта (3 - 4 мин) не разлагается в зоне ионита, Сохранность глутамина подтверждается методом тонкослойной хроматографии. Раствор с колонн вытесняется водой. Начало и конец сбора обессоленного натив- ного раствора согласуют с коэффициентом рефракции, который должен в начале достигать значения 1,334 и в конце опускаться до 1,335. После обессоливания получают 6,1 л раствора с концентрацией глутамина 26,6 г/л и солей 25 мг-экв/л. Затем его пропускают со скоростью 4 объема через стеклянную колонну емкостью 4 мл со смолой ИАв С 1-форме. Сбор осветленного раствора контролируют также как при обессоливании.Получают 6,5 л бесцветного раствора с концентрацией глутамина 24,2 г/л. Раствор пропускают через ионообменную колонну емкостью 600 мл со смолой Ку 2 х 8 в Н+-форме, Глутамин на выходе с колонны контролируют количественно методом ТСХ. В процессе сорбции глутамин полностью заполняет колонну без проскока в фильтрат. Колонну промывают одним объемом воды и элюируют 1 л 1 н, раствора щелочи. Сбор богатой фракции начинают при значении коэффициента рефракции 1,335 и заканчивают при значении 1,338. Получают 930 м раствора глутамина с рН 6,1 и концентрацией 158 г/л, Далее отбирают бедную фракцию до значения 1,334. Всего собирают 170 мл бедной фракции с концентрацией глутамина 35 г/л. Богатая фракция охлаждается до +5 ОС и через 10 ч из нее выпадают кристаллы. Их отжимают на центрифуге, Получают 160 г кристаллов с влажностью 190. Продукт подсушивают при 30 С под вакуумом до влажности 1;4 В итоге получают 131 г препарата с содержанием глутамина1740419 Составитель О.Комарова Редактор Т.Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор О Кравцова, Заказ 2051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 98,5. Продукт мало отличается по внешнему виду, физико-механическим и химическим характеристикам от препарата фирмы "Серва". Выход от исходного количества глутамина 70. Но поскольку 780 мл мэточника с концентрацией глутамина 22 г/л и 170 мл бедной фракции направляются снова в процесс на стадии.осветления нативного раствора и не являются потерями, реальный выход продукта составляет 80.П р им е р 2,5 л культуральной жидкости с активностью 36 г/л обрабатывают и фильтруют как в примере 1, получив 4,8 л натив- ного раствора с концентрацией глутамина 34 г/л. Раствор пропускают со скоростью 2,5 л/ч через стеклянную колонну диаметром 7 см, высотой 65 см, в котоочю было загружено 2,5 л смолы Ку 2 х 8 в Н+-форме, В фильтрате глутамина не обнаружено. Элюцию глутамина осуществляют 2,5- ным раствором аммиака в количестве 3 л. Получают 2,6 л раствора с рН 10,8, концентрацией глутамина 46 г/л и содержанием посторонних катионов 20 мг-экв/л. Раствор упаривают до 1,5 л и концентрации 92 г/л и пропускают через колонну емкостыс 400 мл со смолой ИАв СГформе. Получают 1,8 л полностью обесцвеченного раствора с концентрацией глутамина 74 г/л. Осветленный раствор пропускаютдо полного поглощения глутамина через колонну с 600 мл смолы Ку 2 х 8 в Н -форме, Глутамин элюируют 0,9 л 1 н.раствора щелочи. Собирают 780 мл бога той фракции с концентрацией 155 г/л и 220мл бедной фракции с концентрацией 36 г/л.После кристаллизации глутамина из богатой фракции получают 103 г сухих кристаллов чистоты 98,5 с выходом 57 от исходного 10 количества. 280 мл бедной фракции с концентрацией 38 г/л и 67 мл маточника с концентрацией 27,8 г/л возвращают в процесс, Таким образом, полный выход продукта 72 .15 Формула изобретения Способ выделения глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной 20 жидкости, очистку от примесей полученногоглутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, по сле очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2 х 8 в Н -форме и элюируют его раствором щело+чи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.