Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны

(51)5 А КОМИТЕТИ ОТКРЫТИЯМ ГОСУДАРСТВЕННЬПО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГКНТ СССР ЕТ П ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ЛЮЦЕРНЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может испольИзобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может быть использовано в клеточной селекции при создании нового исходного материала, в частности в клеточной селекции люцерны.Цель изобретения - повышение соле- устойчивости растений.Способ осуществляется следующим образом.В качестве исходного материала используют среднеазиатские сорта люцерны. В качестве эксплантата берут листья, растения предварительно стерилизуют в 0,1- ном растворе диоцида, Каллусную культуру получают на среде Гамборга В 5, содержащей дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 - Д) 8 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л, кинетин (КИН) 8 мг/л. Клеточную суспензию получают на жидкой питательной среде с фитогормонами 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л КИН, Полученную клеточную суспенэию подвергают ультрафиолетовому облучению, которое проводят в асептических зоваться в клеточнои селекции люцерны при создании нового исходного материала, Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3 - 4 ч облучают ультрафиолетом, затем промывают 3 - 4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрйя в количестве 1,25 - 1,67 при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению, 4 табл,условиях в чашках Петри на расстоянии 15- 20 см от источника облучения с длиной волны 304-410 нм. После облучения клетки промывают 3 - 4 раза питательной средой при рН 5,8 с последующим определением их жизне- и эмбриогенной способности, Клеточную суспензию с жизнеспособностью выше 30 переносят на селективную питательную среду, содержащую комплекс солей. Суспензию, выдерживающую высокие концентрации комплекса солей, культивируют 3-4 пассажа по 25-30 дн, после чего получают эмбриоиды и растения-регенеранты.Способ иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Для мутагенного воздействия УФ-облучения используют суспензии, содержащие не менее 800 тыс.клеток в 1 мл с жизнеспособностью 85-95. Если в суспенэии имеются клеточные агрегаты, то их предварительно отфильтровывают через сетку для получения гомогенных клеточных1687139 Таблица Время об- Количество лучени живых клеч ток в 1 мч Х от контроля ичество Х от конт 8614 78 г, 6453,9 30+2,6 15215, 676+4,138+2,5Эмбриогеннанткань 95,5 81,О 71,0 3 З,О 1135628 Кдиннчньеклетки 90+1, 6 13435 1 ОО 100 Контроль Та блиц а 2 ТКо нцентПри обработке Бее обРаботкн Уф Пр ме Содержание соли рация солей аС 1 на 250 Х атм. Индекс аианеспростасобность НаС 11 а ЯО ив неспобностьХ 0 35: 0,70 0 49: 0,97 0,70:1,38 78 7 О 81 39 78ЗН24Некроа 2,9 фо 5 1006 Ко нтоол1,46 7, О-О, 1,6+О, Некроа суспензий, которые разливают по 15 мл в чашки Петри в условиях асептики. Промывку повторяют 3 - 4 раза, После этого определяют жизнеспособность и эмбриогенную способность (табл.1). 5П р и м е р 2, После облучения промытые клетки переносят в селективную питательную среду Гамборга В 5, содержащую смесь солей сульфата и хлорида натрия (табл,2).Как видно из табл,2, ультрафиолетовые 10 лучи повышают жизнеспособность клеток люцерны, Наиболее высокий индекс роста и жизнеспособность на 25-е сутки культивирования наблюдают при облучении и концентрации солей 1,5%, что в 2,1 раза выше, 15 чем у необлученных клеток, а при концентрации соли 1 индекс роста и жизнеспособность практически не отличаются от контроля, При концентрации солей 2 жизненная функция клеток ингибируется. Та ким образом. ультрафиолетовое облучение увеличивает выход клеток, устойчивых к действию комплекса солей,П р и м е р 3. Для доказательства интервальных значений приводится табл,3, где 25 ингибирование жизненных функций культуры ткани люцерны наблюдается при соотношении солей от 0,42:0,83 до 0,56:1,11 или от 1,25 до 1,67.П р и м е р 4, Облученные ультрафиоле товыми лучами клетки промывают в стерильной питательной среде в условиях асептики. Действие кратности промывок в стерильной питательной среде при рН 5,8- 6,0 на плотность и жизнеспособность кле ток люцерны иллюстрируется в табл,4, из которой видно, что на 6 день после 3 - 4-кратной промывки наблюдается наиболее высокая жизнеспособность. При увеличении числа промывок жизнеспособность изменяется слабо.После 3-4 пассажей на селективной среде отбирают устойчивые к смеси солей клеточные линии люцерны, получают растения-регенеранты, 40 о 7 ь которых выдерживают сильное засоление в природных почвенных образцах с преобладающим сульфатно-хлоридным типом засоления, Получены семена от растений-регенерантов в условиях комплексного засоления.Формула изобретения Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны, включающий получение каллуса из эксплантэтов, получение из каллуса суспензии клеток и перенос ее на селективную питательную среду с последующим получением растений-регенерантов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с Целью повышения солеустойчивости растений, перед переносом на селективную питательную среду на суспензию клеток воздействуют ультрафиолетовым облучением в течение 3 - 4 ч, после чего облученные клетки промывают 3 - 4 раза стерильной питательной средой с рН 5,8 - 6,0 в условиях асептики и в качестве селективного агента используют смесь солей сульфата и хлорида натрия в концентрации 1,25 - 1,67 о 7 ь при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению,1687139 Та блица 3 Концентрация Содержание соли Е от контроля Индексроста солей ХаС 1 и Ма 30,7 атм Е 4 - т Таблица 4 Без продувки Промывка Срок,сут Плотность шт (мг) жизнеспособность, Х 1-2 раза 3-4 раза 5-6 раз Ф 241, 1/30, 2 240, 6/23, 0 243, О/16,5 243,6/единичные клетки 241,3/33,0 240,6/35,0 249,2/33,2 242,2/32,8 245,4/33,2 259,8/45,8 268,6/55,4 277,2/57,2 246,6/33,0 260,4/45,6 263,2/55,8 278,2/59,0 1 23 6Составитель В,ДемкинРедактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Ко ектор Л.БескидРР Тираж ПодписноеЗаказ 3655етениям и открытиям при ГКНТ СССРВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откры113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Пате