Способ получения литического фермента

О П И С А Н И Е 3480 ОИЗОБРЕТЕНИЯ Сокэ Ссветскик Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ вцсмыц от патент М, Кл. С 12 с 1 1 аявлецо 12,111. Юо 1412761/28 Приоритет 12 П 1,196 ъ 18312/69, Япония) 1 очитет па волокизобретсиий и сткрьпри Совете МииистСССР пи ров УДК 577.15,08(088 Опубликовано 10.И 11.1972. Б)оллетець ЛЪ 24 Дата опубликования)пс 1 цця 05.1 Х.1972 Авторизобретсци ИностранецХироси Оказ (Япоция) Заявители цостраццая фирмаейяку Кабусики КайшиностранецХироси Иизука.л ,М ОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕН СПО Изобретение относится к области бцкрэбиологической промышленности, а именно к получению ферментов, способцых лизцровать оболочку клеток С 1)1 огеИЯ, дрожжей ц т. п.Известен способ получения литического фермента путем выращцвацця его продуцецтов ца питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии мицеральцых солей с последующим выделением фермецга из культуральцой жидкости.Предло)кеццый способ отличается от известного тем, что в качестве продуцецта используют микроорганизм Мсгоро 1 уз рога 434. При этом выращивание последнего желательцо производить при температуре 40 - 60 С в течецие 16 - 24 час,Микроорганизм Мсгороув рога 434 имеет следующую характеристику,Морфология. Воздушный мццелий диаметром около 0,7 - 1,0 лк, разветвленный, умеренцо прилипший к среде, белый,Субстратцый мццелцй немного тоцьше, чем воздушный; диаметр около 0,5 - 0,7 лк, имеет тсцдсцццю проццкать В яГяровую среду.На поверхцости агаровой среды, часто цаблюдается скопление из куполообразцых образоваццй.Споры сферические или овальные, диамегр цх около 08 - 1,0 лк, ооразуются главшм образом сбоку мццелия, Ицогда цаблюдаютс;1 отдельные споры, цо главцым образом цепочки пз 2 - 10 спор. Цепочки прямые, сравццтсльцо легко разделяются ца отдельцые споры и при выращивании со встряхиванием це цаблюдается цепочек длиннее, чем из 2 - 3 спор. Спцральцые це образуотся,Прц прорастании спор цаблюдается в 2 трубчатых зародыша.Фрагментов мццелця в чашках Петри це наблюдается, цо часто встречаотся фрагменты в 5 - 20 1 к прц цамазывацци ца стекло.Кяк показывает хроматОГряфичсскци яцялцз ца бумЯГе после Гидролиза клеточной Оболочки 6 Н НС 1 клеточная оболочка состоит цз мезо-а, е-диахццопомелицовой кислоты, ярабицозы, галактозы и т. д.Физиологические признаки, 1-1 а сахарозоццтратцом агарс це растет.На глюкозо-аспарагццовом агаре цс растет.На глицерцц-аспарагццовом агаре ро:т умеренный, На цоверхцости среды образуотся тссцые слои. Субстратцый мицелцй светло-корцчцевый. Воздушный мццелцй белый.На жидком агяре рост хороший. Воздупцый мицелий белый, Субстратцый мицелцй светло-коричцевый, Растворимого пцгмецтя пег. Среда имеет порошковатую поверхц)сть.Агар с желатицой. Через четыре дця црц 50 С цаблюдается большой рост ца поверхцости среды. 113 второи,снь ря:)ки;1(сшя студня нс идблюдастся, ио иа четвертый лсиь и;1- Олюдается умеренное разжижение.Среда Беннета. Хороший рост. Воздушный мицелий Ослый, Субстратный мицслии Гвсгло-коричневый, Растворимый иигм(чт Гш. Глокоричисвого цвета..(СГЯр . Кряк.с(10(1 И ИСОрГс 1 ИИСГ(И)111 СО 5 в .ми. "1 срсз чстьрс при 50" С рОГя ис Г. 1 с 1 зжи- ЖС,ИИ 51 КРЯХ)12(с 1 ИСТ.Л 1 яр с 1(рях)я;1 О) и мясиьм исито 0)1. ХО- рошии рост. В(е 5 луиии (133 цсхгии 1 с)сГ 111, Сс б (ГГРс 1 ТЫ 11 )1313 Г(11313 С 15(Т;1( - К)3111 С 35 ЫИ, 1 с 3 ВС)р 31)ыи 131 3 С 331, Г 5 С 1(30-ко 33 ИГЫ. С)сз лвя ля ир; 50 С крх)л Полнос 3 илш- , 1 3 1:5 У С Т С 51 .скстр 3 ио-кс);5 сиио 53 Й с 1 гя. Х 03)ош 3 и рос Г. Воздушный мицслий желтовато-белый. РЯГ- творимый иигмсит светло-желто-коричисЫЙ.1 Итрст 1 с 51 Грслд. Гоикий пл(икобр.5 И.и рит. ВОЗ;уциыЙ 3 цел иЙ бс(ый.11 итрят нс восстяиявлВст,1 с 1 (1 с 1 КМ УГВОМ МОЛ 03(с РсС."1 С Г Г ОбРс 1 503511- иП.м 3,0 лсс. 1 срсз л 13 лия ир:3 50 С иаблюСгсГ 51 3 с 33 оиизяЦИ 5.113 3:дргофельиой массе рося исг.,С(1 Л 10 ЛОЗО-ЯСПЯРЯГИИО 251 СР(5 ЛЯОГТЯ ИСТ, 1 ССЛЛ 10(05 с 1 ИС ЯЗЛ ягясС 51.1 Сс(л 10 лозо-Лскстриио-кязсиио 5351 Грс;13. (1 срсииыЙ рОст В В 1 лс кОлоиии. ВО 5; и 1 иьи )ицсЛИЙ бельЙ. ГОчи ис иябл 0;сс тс 51 рз(1. ЖСИ 51 ЦС ЛН.ОЗЫ.112 питтс(11 ИОЙ с 13 яро 5( 3 ср,1( ис Г рОГ 3", 3 ри 8(, Гля(ыи 3)ос 1 ври,)(, у:(1 срсии 31 и 533 40 - -45 33 хороший рос ири И) 45 С. Умсрс 3- иыи рост, ио слябос сцсилсиис 1)озл) и)иого м 3- цслия ир 5560" С и Плохой рост ир 3 65 С.Споры ис пояоают ири тсилоьч)й 0)ряботц В тсчеиис 1 О лгпи ири 100 С. 1 ри экстрс)кСИ 3 10 р 51 Ч И М 80 (О . И Ы Х ЭТ 2 И ОЛ 0 )1 И я б(110;с С 1 Г 51 И р И- сутс Гвис 2,б.лииоколсииовой кислоты, .-) 10 Г фяКТ ИС. Ис 1 С)ЛОЛЯСТСЯ;СЛ 51 ИЗВС(П ПОГИ Родс. Г 1 И Т я ТСЛ Ь И д 51 С р С,с 1, И .) И )1 С И 51 С ) 3 с 1 51 И р И И р ( 1- (1 ОЖС 3(ИОМ ГИОГООС, С)ЛСР 3(31 3 ГТО ИКИ УГЛСРодс 1 с:50 ТЯ, ИОРГИИСГК 13 Х С)(3033 И ОРГИ 1 сских 3 итятсльиьх си(сст 15. 11 с"10 Пикс)г ул(.- родс (10 ЖС Г ОЫТЬ ПОЛИ.(Ср, 151 С 1(3,313 С рс 135 ИИ- тельио высокую Гтсисиь иолимср 133, и- и )и м с 3 кдх)дл, лскс 1 Р Я и(с(с ГР 131, и и У(1 3111 И Т, И., ИО СЯХсРЯ, И)СЮЩИС И.3 К)10 СС.ИСИЬ иолимсриздции, ияпримср, мшОсяхдрлы, лисахярилы и т. п. сиригодиы. Исгочиикдми Я 3 0 Т Я .(3 О и С Т 0 1 Т Ь С , 1 Ь ф Я Т Я М М 0 И И 51,(10 Р И Л с 1 г 1)0 И И 51, ф 0 С (1) с 1 Г с ) 3 ) 3 0 И И 53И 3 1 Р с 1 Т с 1 М01 И 5 И 1. И 11 ЕОГ 2 ИИЧССКС СОЛИ ЛОбсц 5 Л 5110 1.51 К СРСДС В КаЧЕСтВС ИСТОЧНИКОВ РЯ;5(сИЬХ ЭЛСМСИ 05, СУП(СС ТВСИ И 1 Х ЛЛ 51 РОС 1 Д М И КРООР 1 Д И И;513могут прслстялять и)дходящую комбиияц 10 Рдзги 111 х (1)ОС)счт 015, кЯлиЙПх, )3331 Г,55- сЛИП ЫХ ЦИИ КОПЫ Х .(1 С,Ик, ЖГЛСЗИ Ь 3 Х, М с Р Гсцц(.ВЫХ И 1, И, СОЛСИ. В КЯЧСС.3 ВС Ор 1 ЯИИЧССКИХ ИИТЯ 1 С.ЛЬИ 1 Х 5 СИ(ССВ ЛООЯВ,151 ИТ Тс 11.3 С 1)СИССГТ 52, КЯК 15 ИТс)МИИ 1, )ИИОКИСЛОТЫ ДРОЖ- жс:ВОЙ иОлод 035 Ы(3 э;ст 33(ты и т. л. Среда может таккс состоять из сущесгвснио важных неорганических солей и живых клеток искоторых дрОкжсй, хлорсллы, ГэиокОВ, бактерий и т. д., которые подвергаются дейст вию фермсшга "астоящсго изобретения. В поГлслис.м случ яс жи ы(, 1(лстки с чужят В качеГтс ис0 И 11 кя уггс роля, дзота и питательиых веществ, и) лучшие результаты могут Оыть Лостипуп соли к среде добавляют 10 дрожжевой и солоЛоьый экстракт и т. д.Выращивание обычно иачииают суспендироашем Мсгоро ув рога 434 в стерилизо- яПОЙ 150 дс. Иут1 исрсиося ис.т,1 с.Й и;яти ПООй иглы чистой ку(3 гурь и, Обявлсиия иолучаю цсйся Гусисизи к иитятсльной среде оиисаиИо О ВЫШС 1 ИИЯ. В 1 рс 11 цц 1)сИИС 001 сцО Зяяац 333152 ЮТ:53 ИСряод 16 -48 с(С С 2 ЭрцрОВЗИИСЫ ири тсмисратурс 40- 60 С. 20 ссрхСит иакапливается во время выращивания в культуральиой жилкости и верхний слойпосле удаления мицслия, например, цсигрифуГироваиисм, может иримсияться как такоВОЙ;ля лизиро 5 ди 5 клсточиой Оболоски или МО 25 жст высушиваться ири температуре виже 0 Сдля получения его В виде порошка.,л 5 Получсшя более очищенного преиарата раствор иеочищсиного фсрмситд высаливают сульфатом ам мои)я или обрабатываютЛО ацетоном для осаждения фермента. Высалива Пс производят путем добавления сульфатаяммоиия к расгору фермета до степени цаГыщсиия 0,4, улялсиия образовавшегося осадкя, ляльнсйшг,00.сия до стсисии насы 35 ц.иия 0,6 и ск)брация осевшего фермсита.,осавг 5 Ть сульфдт аммония можно за одинПриемуи 3 с результаты в этом случае получают, если сульфаг аммония добавляют достсисии иясыи(сии 51 0,8. С другой стороны для40 осакдсиия фермепа можно обрабатыватьраствор яетсяом. 11 аилучший результат получяюг при медленном лобавлеиии ацстоца до3(03 и(е 33 тргции 600(о и отдслсиии осадка послеисрсмешияиия в течение 1 гас. Полученный45 фермент растворяют затем в подходящем буферном растворе, ианример в 0,01 и. растворе КГ 1 РО) (р 11-=7,0) и диализируют в тот жебуфсриый ряствор. Виутреииий раствор (расг 50 р, остающийся мешке из мсмбраиы после50 Лиализд) ирсдстявляст высоко чистый растворфср)сипя, его можио высушить при температуре ниже 0 С аналогично сочищеи 03(1 у растору фермента.11 рслложсниый литичсский фермент имеет55 Гледуюцие хярдктеристики.Устойчив в Пределах р 1 5,0 - 9,0. Оптимальный ирслсл р 11 7,0 - 8,0,Лктивси ири темисратурс 40 - 70 С, в особеиост ири 5060 С.60 1)улучи Глойким ири низкой температуре, оиис дсздктивирустся ири 0 С и теряет активность ири 100" С за 10 5 гггн,Легко рястворим и воде и в разбавленныхрастворях солей, но ие растворим в ацетоне.65 Сильно иигибируется ионами Лд+, Сц, 348010Нд, Гс, Хп, Сд, % и умеренно Мп, Сог+, но активируется и Мц.Полученный литический фермент пригоден для экстрагирования многих полезных внутри- клеточных веществ, например протеина, нуклси новой кислоты, аминокислот, витамина и др,П р и м е р 1. В среду А производят посев Мсгороуз рога 434. Среда содержит 5 г живых клеток Сапйса гцдоза 1 Г - 101; 1 г КНРО; 0,5 г Мд 504. 7 НО и 1000 мл дистиллированной водь; рН 7,4. Выращивают со встряхиванием 24 час при 50 - 55 С, после чего живые клетки Сапйс 1 а гпдоза с - 101 полностью растворяются Голученнуо культуральную жидкость затем цснтрифугируют при 5000 об 7 лцлн в течение 10 мин, клетки и споры Мсгороуз рога 434 удаляют. Получают неочищенный раствор фермента, обладающий большой активностью по растворенкио клеточной оболочки.Готовят суспензию живых клеток каждого вида дрожжей, перечисленных в табл. 1, с концентрацией 10 мл, содержащую 0,1% 1 Р 04 и 0,05% Мд 504 7 НаО в дистиллированной воде и рН доводят до 7,4. Применявшиеся дрожжи, содержащие живые клетки, получают посевом этих дрожжей в среду, содержащую глюкозу, (ХН 4) 2 с 106 КН 2 РО 4, Мдь 04, солодовый и дрожжевой экстракты, имеющую р 1- 5,4. Выращивают их встряхиванием 24 час при 30 С,Затем после доведения неочищенного ра;- твора до рН 7,4 к каждым 3 мл этого раствора добавляют 0,2 мл суснензии живых клеток и смесь слегка встряхивают 4 час при 50 С Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что большая часть дрожжевых клеток разрушена и растворена.Уменьшение мутности реакционной смеси, указанное в табл, 1, определяется визуально Гри плюса обозначают полное растворегие клеток, два плюса - умеренное растворение и один плюс - слабый лизис клеток.Степень лизиса клеток вычисляют по следующей формуле:" -У 00,5,где Я - исходное число клеток;5, - число нелизированных клеток, остающихся в реакционной смеси. П р и м е р 2. В стерилизованную при 120 С в течение 3 мпн среду Б, содержащую около 10 г увлажненных клеток СЫоге 11 а е 1 рво ие 11 а 1 аппда; 1 г Кг-РО 4, 0,5 г МдЯОяХ 7 Н,О и 1 г дрожжевого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды с рН 7,4 засевают мицелий Мсгороуз рога 434 и выращивают при 50 С 24 час, Нелизированные клетки С 1 огеа удаляют центрифугированием для получения неочищенного раствора фермента, который имсег большую активность по лизированию живых и теплообработанных клеток (при 98 С Змин), Таблица 1 хх о Эо х о,ио о дох ххахои "г Штамм х ЕоЮ а) Ох 1 +4.К 3,0 мл полученного таким образом раствора добавляют 0,2,ил суспензии клеток СЫоге 1- 25 1 а (ЗА 0" мл) и смесь выдерживают при 50 Св течение 18 час при легком встряхивании. Получсшпяс результаты показаны в табл. 2, где мутность дана в величинах оптической плотности, измеренной при длине волны 530 ммс, 30 Стандартный раствор готовят путем добавления к суспснзии С 1 огеа фосфатного буферного раствора (рН 7,4) вместо раствора фермента в количестве равном раствору фермента. Таблица 2 Мутность Время реакции, чпс 1 д х о о цЛ Ф х Ю (я о,х 31 о ц аа ао, . 2 о охщ Клетки 40 Живые клетки 0,78 0,77 3 19 0,70 0,56 0,84 0,80 3 19 0,77 0,58 П р и м е р 3. К неочищенному раствору фермента, полученному как в примере 1, добавля ют сульфаг аммония до степени насыщения0,4. Образовавшиеся осадки удаляюг и сульфат аммония добавляют до степени насыщения 0,6. Полученные осадки собирают центрифугированием и суспендируют в дистиллиро ванной воде. Суспснзию диализировали черезцеллофановый мешок для получения очищенного фермента.Полученный очищенный фермент добавляют к жидкому образцу, содержащему мицелий 60 Лврего 1 цзогга 1 АМ 2024. После выдерживания смеси при 50 С в течение 4 час большая часть клеточных оболочек мицелия была разрушена.К 0,3 мл суспензии клеток (10 а пл) Езсзеге сЫа Со 1 1 АМ 1264, обработанных при 90 С 10 Сапйга гцдоваСапсса Кгцве 1 ЗАМ 480Сапйга Кгцвс ЛАМ 4489Саидиа цив 3 АЧ 4 о 15Саи 111 а ц 11 в 3 АМ 4295СапдЫа рвсгн 1 огор 1 са 11 в 3 АМ 482915 Сапйс 1 а рагаря 1 опв,1 АМ 4488Саниа 1 роугса ЛАМ 4947Вассгашуссв сегсп ва 1 3 АМ 4039ВассЬгашусев сегежкаа 1 3 АМ 4308Ьасйгашуссв састасг 3 ЛМ 4801Рсна шенйгапае 1 ас 1 спв .АМ 4025Напве 1 ц 1 а апгипа 1 а 3 ЛМ 4668ВсИг овассйгошуссв ровцЬе 3 АМ 4879 45 Теплообработанные клетки 81 90 100 90 86 83 92 93 42 61 81 77 86 65348010 Составитель С. Могилевский Корректор Е. Чихеева Техред Т. Ускова Редактор А. Бер Заказ 2687/16 Изд.1141 Тираж 406 ПодписноеБНИИПИ Комитета по делам изооре)ений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб, д, 45 Типография, пр. Сапунова, 2 3 5 ин, добавляют 2,0 5 л раствора фсрмсцга, полученного в примере 3.После доведения рН до 7,4 смесь выдержива 10 т 4 час п)з 50 С. Около 70% клстос ОЛо разрушено.Г 1 ример 4. В среду В (содер)кясцу)О 20 крахмала; 2 г (г)Н),501; 2 г КН 210,; 5 г К,НРО.,; 2 г М 580. 7 Н,О; 0,006 г С 110 5 НзО; 0,001 г ГеЯО, 71-1 О; 0,008 г МИС 14 Н,О; 0,002 г Хп 80. 71-120 и 10 г дрож 1 ссвого экстракта в 1000 4 л дистиллироваицой яды при рН 7,4) засевают М)сгоро 1 ув рога 434 и выращивают ири встряхивании ири 50 С в течецис 24 час.Культу)эяльцу 10 жидкость цсцтрис 1)угиру 101 при 5000 об,ин 10 лин. Мицелий и споры удаляют и получа)от раствор неочищенного фермента, обладающий большой активиостью по лизировацию клсточцык оболочек,К полученному раствору цсочищсицого фермсцтя дооавл 5110 т сульфат 11)1 мОИИ 51,сс) стс.ис.- пи насыщения 0,8 и смесь исремс шивак)т 4 .5 час при 5 С, при этом получа)от ко 1)ичцсвый осадок. Последний отделяют цсиприфугировдцием при 10000 об/исн, растворяют и 90 л 0,01 М растворд фосфатиого буфера (р 11 7,0) и диализируюг в тот же буферный раствор при 5 С. 11 олучают раствор очигце 1 шого фсрмента, который высушивают при низкой температуре, Получают 195 г чистого ферецта в виде порошка,Г 1 р и мер 5. К раствору цеочигцеццого фер мецтд, получсццого как в примере 4, поддер)сивяемому И 1 зи 5 С, добавляют ацеточ при псрсмсшивации;1 о дости)кеция ацетоцом 60%-цо 1 коццсцтрации и продолжают псремешивацие 5 час. Образовавшийся осадок отде ляют цситрифугировацием при 10000 об лин10 лин и растворяют в 90 мл 0,01 М раствора фосфорного буфера (рН 7,0). Полученный раствор диализируют в тот же буферный раствор ири 5 С и получают раствор очищенного 15 с)срмецта,П редмет изо бр етец ия1, Способ получеция литического ферментапутем выращивания его продуцецтов ца пита тельной среде, содержащей источцики углерода, азота, в присутствии мицсральцык солей с последующим выделением фермента из культуральцой жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцсцта используют микроор )дцизм МСгороув рога 434.2. Способ ио и, 1, отлссчаюиисся тем, чтовыращивацие осуществляют при температуре 40 - 60 С в течение 16 - 24 час.