Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов

, 6 01 И 21/75 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР Е ИЗС)БРЕТЕ ПИ Я ЕТЕЛЬ АВТОРСКОМУ С(56) Апаут. Воспеп),метода лежит количественное определение УФ-индицированных сшивок ДНК-белок в присутствии и отсутствии исследуемых веществ посредством диссоциации раствором 1,5 М КаС в 10 ДДС, разделения на ДНК и ДН К-белковый комплекс центрифугированием на холоду и регистрации спектра гель- фильтрации раствора облученного ДНП через колонку с полиакриламидным гелем АСА. Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок (и) используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (5,) и после УФ-облучения (ЯУф) по формуле (Як-БУф)/Як х 100;4 = и. Эффективность действия химического соединения может быть охарактеризована двумя способами: по расчетной величине и, а также по кинетической оценке выхода сшивок от дозы облучения - константе К, определяемой как тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости п от дозы облучения.1 табл., Миль и Г.Я, Коло 1985, ч. 149, р. 575-5 ЕДЕЛЕНИЯ СШИВОК ЗУЮЩИХСЯ В ХРОМАИЕМ ФИЗИКО-ХИМИфизико-химисшивок ДНК- о-химических нение при по- но действую- клетки. Целью ение точности оба, В основе носится к ределения ем физик йти приме збиратель й аппарат ся повыш рение спос ДНК и гистоно чением количе ном растворе д М хлориде нат са. и уменьше ДНК. Данное о для определен белок и диссо ДНП в зависи присутствии ис нений,В основе определение ДНК-белок в и Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНК- белок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки.Целью изобретения является повышея и ускорение спося уве гов 1 трия и компл вободнользует в, что.сопр ства нера одецилсул рия ДНК-б нием кол бстоятель ия степен циации с мости от пытуемых овождает створимо ьфата на елкового ичества с ство испкой ся д и сшивания ДНК- вободной ДНК из дозы облучения в химическихсоедив том, что испольиополимер ДНП. П УФ-светом.приакции - образоваместах контактов(54) СПОСОБ ОПР ДНК-БЕЛОК, ОБРА ТИНЕ ПОД ВЛИЯН ЧЕСКИХ АГЕНТОВ (57) Изобретение от ческим методам оп белок под влияни агентов и может на иске препаратов, и щих на генетически изобретения являет определения и уско ние точности определенисаба,Способ заключаетсязуют УФ-облученный бОблучение растворов ДНводит к специфической рнию сшивок ДНК-белок в метода. лежит количественное УФ-индуцированных сшивок рисутствии и отсутствии исс 1664844ледуемых веществ посредством регистрации спектра гельфиль 1 рации раствора ДНП через колонку с полиакриламидным гелем АСА,Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (Бк) и при Уф-облучении (Яуф) после прохождения колонки с АСАпо формуле(5 к Яуф)/Як100 = и,П р и м е р, Препараты ДНП выделяют из свежей печени крыс. Для извлечения ядер печень гомогенизируют в растворе 0,1 М хлорида натрия и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин, Надосадочную жидкость сливают, осадок вновь гомогенизируют в 10-кратном объеме раствора 0,14 М КаО с последующим центрифугированием взвеси при 4000 об/мин в течение 15 мин, Операцию промывания осадка проводят 5-6 раз с целью удаления липидов и растворимых белков,Для извлечения ДНП полученный осадок ядер подвергают гемолизу в дистиллированной воде (рН 6) и оставляют на холоду в течение 30 мин. Первый гемолизат сливают, а промытый осадок вновь заливают дистиллированной водой и оставляют на мешалке (3000 об/мин) на холоду в течение 12 ч,Полученный гелеобразный ДНП осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 18000 об/мин,Все операции по получению ДНП осуществляют при 4 - бС,Полученный препарат характеризуют по количественному соотношению ДНК: белок методом Лоури. Содержание белка в препаратах ДНП составляет 50%.Образцы ДНП в трис-буфере 0,05 М, рН 7,4 с исходной оптической плотностью при 260 нм, равной 1, тщательно смешивают с растворами препарата СД-б различной концентрации в той же буферной системе и подвергают облучению разными дозами Уф-света с А 254 нм при температуре 22.5 С. Мощность лампы 5,7 10 кБ/мм с.2,Для отделения сшитого облучения комплекса ДНК-белок к 1 мл облученного в присутствии препарата СД-б ДНП добавляют 0,15 мл 1-ного раствора додецилсульфата натрия (ДДС) и 0,4 мл 5 М МаС 1, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и 2 ч при 4 С, а затем подвергают центрифугированию на холоду в течение 30 мин при 8000 об/мин, Надосадочную жидкость отделяют и анализируют методом гельфильтрации через колонку размером 5 х 60 мм с полиакриламидным гелем, На колонку наносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 М трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадейпиков хроматограммы яклр и Зуф (в конт 5 реле и после облучения соответственно) находят количество сшивок ДНК-белок вприсутствии СД-б, Оно составляет 32 дляконцентрац 5 ии СД10 М при дозе Уф-света 4,8 10 Дж/м, Величина константы К,210 найденная для этой же концентрации препарата, составляет 3,0 10 . Контроль.-2К 1 мл образца ДНП в трис-буфере 0,05М, рН 7,4 с исходной оптической плотностью при 260 нм, равной 1, добавляют 0,1515 мл буфера и подвергают облучению разными дозами Уф-света с Л 254 нм при22,5 С,Для отделения сшитого комплекса ДНКбелок к 1 мл облученного раствора ДНП20 добавляют 0,15 мл 1%-ного раствора ДДС и0,4 мл 5 М КаС 1, смесь выдерживают 30 минпри комнатной температуре и 2 ч при 4 С, азатем центрифугируют на холоду в течение30 мин при 8000 об/мин. Надосадочную25 жидкость отделяют и анализируют методомгельфильтрации через колонку. На колонкунаносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 М трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадей30 пиков 1 Я 0" - необлученного ДНП и Яуф" -облученного разными дозами Уф-света контрольного раствора ДНП(без препарата) находят количество сшитого облучениемкомплекса ДНК-белок (и) и константу К, ко 35 торые составляют соответственно 55 и 1, 10По предлагаемой методике изучаютвлияние на выход Уф-индуцированных сшивок ДНК-белок ряда соединений; СД-ЗО, па 40 рабензохинона, гидрохинона, цистеина идрВ таблице приведены значения и и К дляисследованных соединений в интервале на иболее эффективных концентраций 1010-з МКак видно, наблюдается корреляция изменения значений и и К для исследованныхвеществ и эффективность их действия в равной степени может быть определена каж 50 дым из предложенных параметров, авеличина константы позволяет оценить степень защитного или сенсибилизирующегодействия препарата по отношению к образованию сшивок.55 Предлагаемый способ используют в качестве тест-объекта Уф-облученный ДНП,который биологическим аналогом хроматина клетки, подвергнутого действиям экологического облучения, Известна функция1664844 Составитель Н,КузенковаТехред М.Моргентал Корректор М,Кучерявая Редактор Н.Рогулич Заказ 2366 Тираж 389 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ДНП как носителя наследственной информации клетки, накоплено значительное количество данных, показывающих,.что ДНК-белковые сшивки являются важной компонентой УФ-повреждений в клетке. 5 Например, обнаружены ДНК-протеиновые сшивки в нормальных фибробластях кожи, облученных солнечным светом. Поэтому весьма важной является задача выявления веществ-протекторов ДНК-белковых сши вок.Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность в фотохемотерапии различных патологий химических агентов, вызывающих избира тельные сшивки-ДНК-белок, В связи с этим УФ-облученный ДНП может быть использован для скрининга биологических препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки и обладающих 20 как протекторными, так и сенсибилизирующими действиями по отношению к образованию сшивок ДНК-белок.Преимуществом способа является также быстрота и доступность получения рас творимого хроматина; Использование хроматографического метода анализа УФ.облученного препаратов ДНП позволяет с большой точностью при простоте и непродолжительности анализа получать надежную информацию о количестве сшивок ДНК-белок. Кроме того, предлагаемый способ анализа биологической активности физико-химических соединений по сшивкам ДНК-белок дает возможность работать с микроколичествами исследуемых веществ.Формула изобретения Способ определения сшивок ДНК-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов, предусматривающий диссоциацию ДНК- белкового комплекса, разделение ДНК-белкового комплекса на свободную ДНК и ДНК, связанную с белком,с последующим анализом сшивок ДНК-белок по количеству несвязанной ДНК, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения способа, диссоциацию осуществляют раствором 1,5 М йаО 1 ДДС, разделение на свободную ДНК и ДНК-белковый комплекс проводят центрифугированием на холоду, а количество несвязанной ДНК определяют на колонке, заполненной акриламидной агарозой.