Способ получения пептидов

(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения пептидов, особенно Е-Аа-Аа- ец-рнитроанилида и 7-1 -Азр- -Р 1 е ОМе (аспартама) в присутствии металлопротеиназ. Цель изобретения - повышение выхода трипептидов (Е-аспартама), Способ заключается в связывании 7-Аа-Аа сец-р-нитроанилидом и ЕАзр с -РйеОМе-НС в присутствии протеинаэы из Васцз сегецз Ъ М ЕТ 10700, Металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного афинной хроматографией с бацитрацин-силохромом,1 з,п,ф-лы,6.8 хнологии (ОО) вательский иниромышленных.Л. Остерман,ина, Л.А, Любв (ОО) Азр с Ет)е-омепротеиназы.Недостатком этого способа является то, что при этом образуется незначительное количество трипептидов.Целью изобретения является повышение выхода целевых продуктов,Металлопротеинаэа из В.сегецз ЪМЕТ 10700 применяется для получения пептида 7-Аа-Аа- ец-р-нитроанилида или пептида 2Азр-.-Р)еОМе, при этом установлено, что этот фермент можно испольэовать также в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного аффинной хроматографией с бацитрацин-силохромом.Эффективность синтеза выше, если применяется очищенный фермент. Действенным методом очистки для металлопротеинаэы иэ Вас, сегецз 2 МЕТ 10700 является аффинная хроматография с бацитрацин-силохромом. В результате очистки получают Ъ УДАР СТВ Е ННЫ И КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21)7774327/13(71) Научный центр по биотВсесоюзный научно-исследститут генетики и селекциимикроорганизмовЫО)(53) 668.392 (088.8) Изобретение относится к способу по получению пептидов, особенно Е-Аа-Аа ец-р-нитроанилида и Г- -Азр- -РЬеоМе (аспартама), в присутствии металлопротеиназ.Из обзора ЗОВ/А, Ч, Чцб Сазе Каца 1 ц КусЕа аз), 36, 1978, 195-20 известен способ получения пептидов с использованием протеиназ в качестве катализаторов, При этом используются серинпротеиназы и металлопротеинаэы разного биологического происхождения из Васцз роуглуха, Васцз зцЬтз, Васцз тЬегворготеоуссцз и др.Недостатком данного способа является то. что эти ферменты требуют глубокой очистки,Из описания патента ФРГ ч. 3203292, кл, С 12 Р 21/00, опублик 1985 известен способ получения пептидов путем связывания Е-Аа-Аа с .ец-р-нитроанилидом и ЕНС в присутствии металло1664845 Формула изобретения 1, Способ получения пептидов Е-Аа-Аа ец-р-нитроанилида или Е- -Азр-РЬеОМе путем связывания Е-Аа-Аа сец-р-нитроанилидом или соответственно Л- -Азр с-РЬеОМе-НС в присутствии металлопротеиназы из Васцз сегецз, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевых продуктов, используют металлопротеиназу из Васцз сегецз ЕМЕТ 10700.2, Способ поп 1,отлича ющийся тем, что, металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенную афинной хроматографией с бацитрацин-силох ромом. 35 40 45 Составитель А,УльяноваТехред М.Моргентал Корректор М,Кучерявая Редактор Н.Рогулич Заказ 2366 Тираж 362 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 фермент, почти свободный от углеводов и чужих протеинов. Этот фермент позволяет повысить скорость реакции и выход конечного продукта,П р и м е р 1, 74 мг 2-Аа-Аа и 62 мгец-р-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 500 мкл 50 мМ трис-НС, рН 7,5, с 1 мм Са-ацетата, при 35 С и добавляют 180 мкл фильтрата культуральной жидкости из Вас, сегецз 7 МЕТ 10700, содержащего 140 мкг фермента. Концентрация субстратов при этом составляет по 200 мкмоль, При перемешивании в течение 25 ч при 35 С получено 51 продукта, Качественный анализ конечного продукта проводят тонкослойной хроматографией на силикагельных пластинках в системе н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода в соотношении 10:15:3:12, а детектирование в ультрафиолетовом свете после обработки нингидрином. и с помощью К. после хлорирования, Кроме этого, для качественного и количественного определения конечного продукта применяют НР С. Детектирование проводят у абсорбционного максимума р-нитроанилина (315 нм) после отделения субстрата от продукта в С 18-колонке в ацетонитрильном градиенте, Дополнительно определяют выход У-Аа-Ааец-р-нитроанилида гравиметрическим методом после повторной промывки йаНСО и водой,П р и м е р 2. 74 мг 2.-Аа-Аа и 62 мгец-р-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-НС, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. Общий объем составляет 900 мкл, а концентрация субстратов по 250 мкмоль, После чего доводят температуру до 35 С, добавляоют 10 мкг фермента из Вас, сегецз ЕМЕТ 10700, очищенного аффинной хроматографией, и перемешивают 18 ч при 35 С. Выход Е-Аа-Аа- ец-р-нитроанилида составляет 72 о,П р и м е р 3, 24,4 мг Е-Авр расТворяют в 30 мкл 6 н, чаОН и 42,2 мг РЬеОМе-НС, растворяют в 200 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-НС, рН 5 10 15 20 25 30 7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до 35 С добавляют 100 мкл фильтрата культу- ральной жидкости, содержащего 110 мкг фермента. После перемешивания в течение 24 ч выход составляет 38, Качественное и количественное определение Е-аспартама соответствует методу примера 1, причем детектирование разделенного НР С продукта проводят у 220 нм.П р и м е р 4, 122 мг Е-Авр растворяют в 160 мкл 6 н. ИаОН и 211 мг РйеОМе-НС в 800 мкл 50 мМ трис-НС, рН 7 5, с 1 мМ Са-ацетата, После нагрева до 35 С добавляют 1 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией, в 100 мкл 50 мМ трис-НС, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата, В результате перемешивания в течение 24 ч получают выход Е-аспартама 540 .П р и м е р 5, Способ осуществляют как в примере 4, причем четвертное количество реактандов растворяют в 2,5 мл 50 мМ трис- НС-ном буфере, рН 7,0, с 1,0 мМ Са-ацетата. После повышения температуры до 35 С добавляют 3 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией. Через 5 ч перемешивания твердый осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость снова инкубируют. Образующийся в течение следующих 5 ч осадок опять центрифугируют и определяют количество Е-аспартама, Общий выход составляет 85.