Штамм культивируемых клеток тестикул эмбриона быка, используемый для накопления вирусов крупного рогатого скота

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИС ГИЧЕСКИХРЕСПУБПИК САНИЕ БРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ ТЕЛЬСТВУ аучно-ис артизаци биологи вича и В но-контр следои и конческих сесоюз- ольный нова, И,Л. Гра. Яе 1 апс 1 В 1 о 1, 1970 ед. А КЛЕТОК ОЛЬЗУ- РУСОВ к вирусологии, и культуры клеприменения в та для накоплепного рогатого ется получение в качестве кледукции и выра- рогатого скота. й линии клеток материала исна 8 месячного ор 080 Й коровыГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Государственный нвательский институт стандтроля медицинскихпрепаратов им. Л.А. Тарасеный государственный науинститут ветпрепаратов(54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХЕСТИКУЛ ЭМБРИОНА БЫКА, ИСПМЫИ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА57) Изобретение относится. к области вируологии, в частности к биотехнологии куль Изобретение относится в частности к биотехнологи ток, и касается получения и качестве клеточного субстра ния вирусов заболеваний кр скота,Целью изобретения явля перевиваемой линии клеток точного субстрата для репро щивания вирусов крупного Для получения перевиваемо ТЭБ в качестве исходного пользуют тестикулы эмбрио возраста, полученного от зд Я 2 1664842 А 1Я)5 С 12 М 5/06 туры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота, Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота. Штамм получен из тестикул эмбриона, полученного от здоровой коровы путем переведения в культуру клеток, Регламент культивирования не отличается от общепринятого для культур клеток. Штамм депонирован в коллекции ВСКК(СХЖ) %40, Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при физиологических условиях при достижении конфлюентного монослоя проводят замену на среду с вирусом и инкубируют с Б целью адсорбции вируса с последующим сбором вируссодержащей жидкости и определением титра вируса. Штамм пригоден С для накопления вируса диарен (штамм Орегон С), вируса парагриппаи аденовируса (штамм В),донора, свободнои от вирусов пневмоэнтеритов. Ткань тестикул эмбриона быка тщательно измельчают ножницами и отмывают солевым раствором Хенкса с добавлением 500 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Кусочки ткани помещают в колбу и проводят щадящую трипсинизацию 0,250-ным раствором трипсина при 20-2 С, Цикл повторяют 5 - 6 раз по 5 - 7 мин, Полученную взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, Осадок ресуспендируют в среде Игла МЕМ с добавлением 10, сыворотки крупного рогатого скота,100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл, 166484250 55 стрептомицина. Клетки с концентрацией 500000 кл/мл высевают в матрасы вместимостью 1000 мл при рН 7,0-7,4. После формирования монослоя на первых пассажах на 2 - 3 сут, а в последующих пассажах на 3 - б сут роста, клетки снимают со стекла 0,2 оь-ным раствором версеиа с добавлением 50 мгхимопсина, подогретымдо 37.+2"С и пересевают в соотношении 1:2.Штамм характеризуется следующими свойствами.В условиях термостата при 372 С монослойные культуры сохраняются в течение 5 - 7 дней беэ смены питательной среды при комнатной температуре 202 С в течение 4 сут и при 4 - 6 С 3 сут, На уровне 12 и 17 пассажа заложено на хранение в жидком азоте в сосудах Дьюара соответственно 25 и 32 ампулы, содержащие,по 2 мл суспензии клеток ТЭБ с концентрацией 4-5 10 кл/мл,Для замораживания суспензии клеток ТЗБ применяют 5 или 10-ное криозащитное вещество ДИСО, Для отогрева замороженные ампулы помещают в водяную баню при 37-40 С. При длительном хранении применяют жидкий азот при минус 196 С. Для восстановления культуры, ТЗБ размораживают при 37 + 2 С, суспендируют в ростовой среде, высевают в матрасы и культивируют в стационарных условиях. Пересев клеток производят через 5 - 7 дней, Сохранность клеток после замораживания 90 - 95 ОПеревиваемую линию ТЭБ культивируют при 37"С, рН 7,2 - 7,4, способ культивирования стационарный, среда ростовая - Игла МЕМ с добавлением 10 О/О-ной сыворотки крупного рогатого скота, перевивка 1 раз в 5 - 7 дней, Клетки снимают со стекла 0,02;4-ным раствором версена с добавлением на 0,5 л верссна 50 мг химопсина. При посевной дозе 50 - 100,000 мл/мл монослой образуется на 3-4 сут без смены среды, Кратность рассева 1:2 - 1:3. Монослой состоит из эпителиоподобных полигональных или окружных клеток, Цитоплазма хорошо выражена, ядра округлой формы, хроматин расположен равномерно, Почти в каждом поле зрения выявлены митозы. Клетки имеют четко выраженный модальный класс по числу хромосом (из 46 проаналиэированных клеток 28 содержали по 50 хромосом), Кариотип клеток содержит акроцентрические, мета- и субметацентрические хромосомы. В линии выявлено 18 различных маркерных хромосом, Наиболее постоянным для данной линии оказались 10 маркеров; М 1 - М 5, Мв, М 11, М 14-М 17. 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 По результатам анализа иэоэнзима лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в исследуемой линии ТЭБ и в первично-трипсинизированных клетках почки эмбриона коровы (ПЭК) был сделан вывод о видовой принадлежности ТЭБ к клеткам быка.В перевиваемой линии ТЭБ размножаются с цитопатическим эффектом вирусы парагриппа (ПГ - 3, штамм 3 КСМ), вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ, штамм ТК-АВИЭВ), вирус диареи (штамм Орегон С - 24) и аденовирусы (штамм В). Титры вирусов через 5 - 6 дней культивирования достигают соответственно значений 6, О ф 0,5 д ГЦД 50/мл, 6,1 + 0,2 д ТЦД 50/мл 2,5 + 0,2 д ТЦД 50/мл и 6,10,5 д ТЦД 50/мл.Штамм депонирован в коллекции ВСКК (СХЖ) М 40,П р и м е р 1. Культуру ТЭБ в количестве 2 .3 10 в 1 мл пересевают иэ расчета 1;2-1:3 во флаконы вместимостью 1000 мл с использованием питательной среды Игла МЕМ с добавлением 10; сыворотки крупного рогатого скота. Культуру инкубируют при 37 +. 2 С в термостате в течение 7 - 8 дней. Ежедневно культуру просматривают под световым микроскопом. Через 7 - 8 дней, когда монослой клеток становится сплошным, питательную среду из флаконов сливают в сосуд для отходов, а монослой клеток промывают 3 раза солевым раствором Хенкса для удаления следов сыворотки. Вирус ПГ(шт,З КСМ) вносится в объеме 10 мл и культуру инкубируют 1 ч при 37 + 2 С для адсорбции вируса, затем добавляют 120 мл питательной среды без сыворотки. 2 флакона, вместимостью 1000 мл, оставляют для контроля незараженными. В контрольные флаконы вносят 120 мл питательной среды без сыворотки, Через 6 - 7 дней, когда в зараженной культуре появляются дегенеративные изменения в 75 - 90 монослоя, культуру 3 раза замораживают при минус 20 +1 С и оттаивают, затем вируссодержащую жидкость сливают и титруют на пробирках для определения титра вируса. Титр вируса по результатам 3-х опытов составляЕт 5,9 + 0,5 д ТЦД 50/мл,П р и м е р 2. Подготовку культуры клеток ТЭБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят вирус ИТР (штамм ТК-А - ВИЗВ) в обьеме 10 мл, Через 5 - 6 дней, когда в культуре появляются дегенеративные изменения в 50 - 75 монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодержащую жидкость титруют на пробирках с культурой ТЭБ для установления титра вируса, Титр вируса по1664842 результатам 3-х опытов составляет6,0 +0,2 д ТЦД 50/мл Использованиедля накопления вирусакрупного рогатого скота, перевиваемой линии клеток тестикул эмбриона быка (ТЭБ) посравнению с ранее используемыми первич 5 но-трипсинизированными культурами ТБ иПЭК, позволяет заменить дорогостоящиепервично-тримеинизированные культурыТБ на более экономичную линию, котораяхарактеризуется способностью легко пере 10 виваться в условиях и чтго и размножатьсяс использованием доступных питательныхсред и сывороток и может длительное время храниться беэ изменения биологическихсвойств в жидком азоте. В целом же переви 15 ваемая линия клеток ТЭБ обеспечивает более высокое, чем культура ТБ, накоплениевирусов пневмоэнтеритов крупного рогатого скота. Перевиваемая линия ТЭБ характеризуется стабильными морфологическими и20 генетическими свойствами и простотой получения и культивирования,Формула изобретенияШтамм культивируемых клеток тестикулэмбриона быка ВСКК(СХЖ) йг 40, использу 25 емый для накопления вирусов крупного рогатого скота,П р и м е р 3. Подготовку культуры клеток ТЭБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят аденовиру (штамм В - 10) в объеме 10 мл. Через 5 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75 монослоя, культуру замораживают и оттаивают 3 раза, а вирус- содержащую жидкость титруют на пробирках для установления титра вируса, Титр вируса по результатам 3-х опытов составляет 4,8 .ф. 0,5 9 ТЦД 5 о/мл,П р и м е р 4. Подготовку культуры ТЭБ и культивирование вируса проводят по примеру 1. Вирус диареи (штамм Орегон С) вносят в объеме 10 мл. Через 10-12 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75-90 монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодержащую жидкость титруют для установления титра еируса, Титр вируса диареи по результатам 3-х опытов составляет 2,5 + 0,5 д ТЦД 50/мл,Составитель А,РоманченкоРедактор Н.Рогулич Техред М. Моргентал Корректор М.Кучерявая Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2366 Тираж 374 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5