Способ получения целлюлазы

(51)5 С 12 И ЫЙ КОМИТЕТ ИЯМ И ОТНРЫТИЯОСУДАРСТВЕНО ИЗОВ ЕТЕРИ ГКНТ СС ТЕНИЯ ДДТЕЛЬСТВ АВТ че ских ной би вано в че ской леннос отра сель х про ом хо яйстве. Це расширени тей способакже обре онал ия являет ных возмож и а Изобретло гиче ской спо с е нома м ей яс- ики ИСАНИЕ ИЗ(71) Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производств(56) Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г.Микробиологический синтез белка нацеллюлозе. 1976, с. 150-154,2, Ре 1 гегяеп М. Се 11 ц 1 аяе апс 1 Ргоге 1 п Ргойцсйоп гогот ш 1 хей Сц 1 гцгеяой Тг 1 сЬойегша ИгЫе апй а Уеаяс.В 1 оТесЬпо 1 оду апй В 1 оепддпеегдщ,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ(57) Изо бре тение о тно сится к мик робиологической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитиение относится к микробиопромышленности, а именно ам получения целлюлолитичеснтов, дрожжевой и грибной и может быть использовано ской и микробиологической омпромышленности, а также в сельскхозяйстве.Целью изобретения является раширение функциональных возможносспособа и улучшение качества конного продукта.На фиг, 1 изображена схема, пняющая способ; на фиг. 2-4 - граактивности целлюлазы; на фиг. 5типичные хроматограммы,.,801640161 А 1 ферментов, дрожжевой и грибмассы, и может быть использомедицинской и микробиологиулучшение качества конечного продукта. Способ осуществляют следующим образом. Синтез целлюлазы проводят н среде, содержащей ферментолизат целлюлозосодержащего сырьяПри этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы,глюкозой на ферментолизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют, ферментолизате остаются неусвсенные дрожжами целлодекстрины и метаболи-, ты дрожжей, которые играют роль ростовых факторов для гриба - продуцента целлюлазы, 2 з.п,ф-лы, 5 ил. Способ осуществляют следующим образом.Синтез целлюлазы проводят на сре-де, содержащей ферментолизат целлюлоэосодержащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы глюкозой (т.е. эффект катаболитной репрессии) на ферментолизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют. В ферментолизате остаются неусвоенные дрожжами ;целлодекстрины и метаболиты дрожжей, .которые играют роль ростовых факторов для гриба - продуцента целлюлазы. Продуцент выращивают на целлодекстринах, при этом образуется свободнаяот остатков субстрата пищевая грибная биомасса, а в культуральной жидкости - целлюлаза. Часть целлюлазы .используют как товарный продукт, а часть 5-20%) - на приготовление ферментолизата. ферментолизату целью инактивирования целлюлозы и прекращения дальнейшей деградации целлодекстринов до глюкозы прогревают приоос.В качестве целшолозосодержащих отходов используют макулатуру, волокнистый материал отстойников бумажных фабрик, хлопковый линь, отходы текстильной промышленности - пух Фильтровой, подметь серая, подметь масляная, вискозная рвань. Такие отходы являются нелигнифицированной .целлюлозой и не нуждаются в предварительной делигнификации.В качестве грибов - продуцентов целлюлазы используют следующие штаммы:ТгхсЬойегша 11 япогцш ОИ 534 А 25ТгхсЬойегша чхгЫе чИ 9414Тг 3.сЬойегша 1 хдпогщв 60ТгхсЬойеппа 1 погаа ЯИ 6 АТйсЬойегша ЯопЫр 3. ар.ТххсЬос 1 егша 1 щпогиш 19ЗОТгьсЬодегша чьгЫе НГ В качестве микроорганизмов, усванвающих глюкозу из Ферментолизата целлюлозосодержащих отходов, исполь" зуют любые виды дрожжей, способные к росту иа глюкозе. Однако, учитывая, что оптимум рН получения,ферментолизата с помощью целлюпазы грибов рода ТНсЬойегша составляет 4,8-5,0, наиболее целесообразно применение дрожжей вида К 1 адегошусез (ЯассЬагошусеа) Кгарх 1 з.з, которые имеют тот же оптимум рН для роста биомассы. Это позволяет не корректировать рН при выращивании дрожж 8 й на ферменто лизате; избежать бактериального заражения дрожжевой биомассы в процессе нестерильного культивирования.Схема поясняющая способ (Фиг. 1), включает блок 1 корректироВки рн и О питательных компонентов среды 2, аппарат 3 ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья с транспортирующим устройством 4 и транспортирующим устройством 5 для отвода непрогидролизованного остаткааппарат 6 для культивирования дрожжей с транспортирующим устройством 7 для отвода товарных пищевых дрожжей, аппарат 8 для культивирования грибов с транспортирующим устройством 9 для отНода грибной биомассы и аппарат-распределитель 10 для целлюлазы с транспортирующим устройством 11, транспортирующие устройства 12-17 для подачи в аппараты 3, 6 и 8 нужных питательных сред и=компонентов, а также по" дачи обрабатываемых сред соответственно в аппараты 6 и 8 и аппарат- распределитель 10.Способ получения целлюлазы и микробной биомассы осуществляют следующим образом.Целлюлозосодержащие отходы потранспортирующему устройству 4 поступают в аппарат 3. В этот же аппаратпо транспортирующему устройству 12подается из аппарата-распределителя10 в нужном количестве культуральнаяжидкость, содержащая целлюлазу, а потранспортирующему устройству 14 подают воду, питательные компоненты, вслучае необходимости кислоту, напри-мер Фосфорную НРО 4 щелочь, например гидроокись аммония БН ОН. Этикомпоненты перемешивают в аппарате 3до образования в нем раствора, содержащего питательные компонентыследующего состава, %: азотнокислыйаммоний ЖоЮз 07-1 0 ф фосфорнокисюьпЪ однозамещенный калий КН РО 4,0,3-0,5; сульФат магния 5 дЯО Н О0,05, При этом рН раствора доводятдо 4,5-5,0,В аппарате 3 происходит осахаривание целлюлозосодержащего сырья, таккак целлюлаза, содержащая полноценный комплекс гидролитических Ферментов, гидролизует целлюлозу с образованием глюкозы, целлобиозы и целло.декстринов. различной степени нолимеризации. При достижении концентрацииглюкозы в пределах 1-3% раствор яв 4ляющийся ферментативным гндролизатом,содержащим компоненты минеральногопитания, прогревают в течение 10 миндо 70 С и направляют из аппарата 3 ваппарат б по транспортирующему устройству 15 на дальнейшую обработку.Непрогидролизованный остаток из аппарата 3 выводят по транспортирующему устройству 5,В аппарат 6 по транспортирующемуустройству 18 подают посевной материал для выращивания биомассы, например дрожжи К 1 ирегопусеа йгаф 11 вв количестве 5% от объема среды.45 Дрожжи культивируют до полного по,глощения из среды глюкозы (максимального синтеза биомассы дрожжей). Впериодическом процессе культивирова 5ние дрожжей К 1 цчекошусеэ гад 1 ьзпроводят в течение 20-24 ч при 24-26"Си аэрации в количестве 100-125 объемов на 1 объем культуральной среды в 1 ч. Дрожжи усваивают из Ферментативного гидролизата глюкозу и частьэлементов минерального питания, приэтом в аппарате 6 накапливается биомасса дрожжей К 1 цчегошусез Ггаяд 1 зи растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей. По окончании процессаферментации в аппарате 6 биомассыдрожжей отделяют: фильтруют, сепарируют, уплотняют и так далее (непоказано), выводят из аппарата 6 потранспортирующему устройству 7 и испОльзуют в качестве пищевой белковойбиомассы. Культуральная жидкость изэтого аппарата транспортирующим устройством 16 подается в аппарат 8 длядальнейшей обработки.Кроме того, в аппарат 8 из блока1 транспортирующим устройством 13 подают фосфорную кислоту (или ее водный раствор) с целью коррекции рНдо 4,8-5,0, а по транспортирующемуустройству 19 подают посевной материал культивируемых микрогрибов,напримеррода ТгсЬос 1 еппа в количестве 5-8 Е от объема среды.В аппарате 8 при. культивированиигрибов рода ТкхсЬойегша под действием находящихся в среде индукторов - целлобиозы и целлодекстриновобразуется целлюлаза и одновременно40накапливается грибная биомасса. Приэтом растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей К 1 цчегощусез Гга 81 дзслужат ростактивирующими факторамидля микрогрибов, Гриб рода ТгсЬодегша культивируют до максимальногосинтеза целлюлазы. В периодическомпроцессе культивирование гриба проводят в течение 24-48 ч при 30-55 Си аэрации в количестве 45-60 объемоввоздуха на объем культуральной среды в 1 ч. По окончании процесса Ферментации биомассу гриба отделяют откультуральной среды и по транспортирующему устройству 9 выводят из аппарата 8 для дальнейшей обработки ииспользования в качестве белковоготоварного продукта (уплотнение,фильтррция, сушка, упаковка),Из аппарата 8 в аппарат-распределитель 10 по транспортирующему устройству 17 поступает культуральныйФильтрат, который в аппарате-распределителе 10 разделяют на два потока.Один поток транспортирующим устройством 11 выводится из аппарата-распределителя 10 иа дальнейшую технологическую обработку: сгущение, сушка, очистка и другое (не показаны)с целью получения товарной целлюлазы, а второй поток направляется транс.портирующим устройством 12 для осуществления процесса гидролиэа целлюлозосодержащих отходов в аппарат 3.Способ получения целлолазы и товарной микробной биомассы предусматривает при необходимости стерилиза"цию питательной среды, поступающейв аппарат 8. Технологическая схемаможет быть реализована как в периоди"ческом, так и в непрерывном процессе,В последнем случае посевной материал вносят лишь на стадии пуска.П р и м е р 1. Посевной материалгриба - продуцента целлюлаэы ТгдсЬос 1 егша 18 поппп ОМ 534 (коллекция Института микробиологии АН БССР) выращивают в пробирках на косом агаре,поверх которого помещают стерильныеполоски Фильтровальной бумаги. Дляприготовления косяков используют среду состава, г: ХаМО 5,0; КН, РО 4,0;М 83047 Н О 0,5; агар 20; водопроводная вода 100 мл, Жидкую питательнуюсреду засевают смывом 14-суточнойкультуры из расчета 50 мл стерильнойводы на 1 пробирку с посевной культурой и 1 0 мл суспензии используютдля засева 100 мл среды.В колбу со 100 мл среды помещают2 г Фильтровальной бумаги и культивируют в течение 4 сут до достиженияактивности целлюлазы 1,5-2,0 ед. Нафиг. 2 показаны изменения при культивировании активности целлюлаз пофильтровальной бумаге (кривая 1), активности целлюлаз по растворимой целлюлозе (кривая 2) и рН культуральнойсреды (кривая 3),Грибную биомассу отфильтровываютчерез нейлоновую ткань, а культуральную жидкость подкисляют Фосфорной кислотой до рН 4,8-5,0 и центрифугируют с целью удаления взвешенныхчастиц, Затем к 5 г целлюлозы добавляют 100 мл раствора целлюлазы10 15 20 25 30 Ф 35 45 50 55 7 164вают в течение 1-2 ч при 40 оС. Приэтом происходит распад целлюлозы доцеллодекстринов, целлобиозы и глюкозы. Непрогидролизованный остатокотфильтровывают, а ферментолизат, сцелью инактивации целлюлазнагреовают до 70 С и выдерживают 10 мин.На фиг. 3 показана термостабильностьцеллюлазы (прогрев в течение 5 мин).В результате предотвращения дальнейший гидролиз целлодекстринов до более низкомолекулярных соединений иглюкозы,С целью контроля углеводного состава аликвоту Ферментолизата упаривают на роторном испарителе или ввакуум-сушильном шкафу в 5-10 раз,отфильтровываот и Фильтрат наносятна бумажную хроматограмму, которуюэлюируют в восходящем потоке в системах изопропанал:вода=1:1,6 и этьщаце татапиридин: вода,1: 0,5, Хромато граммы проявляют 1 Х-ным растворомсолянокислого п-анидизина в этанолеили щелочным раствором АЗЮ.На фиг. 5 показаны типичнйюе хроматограммы: а - макулатура, гидролизованная культуральным ФильтратомТ, 1 хдпогцш ОМ 534; б - гидролизатпосле выращивания на нем дрожжейК, йгадх 11 в; в - культуральный Фильтрат К, ккааз.11 в после выращиванияна нем гриба Т. Идпогцш ОИ 34; гсвидетели (А - целлабиоза, В " глюкдза, В - арабиноза, Р - ксилоза,Х - целлоде кстрины) .Целлюлаза Т. 13,рюкцш ОИ 534 образует смесь глюкозы, целлодекстринов,арабинозы, ксилозы, неидентифицированный сахар и следы целлобиозы, поскольку обладает значительной целлобиазной активностью (фиг,.5 а).Для удаления глюкозы из Ферментолизата на нем выращивают дрожжиК, (Засей.) Ггар.1 з (коллекция Института микробиологии АН БССР),Дрояоки К, Кгаф 1 хв выращивают впробирках на скошенном сусло-агаре.В качестве посевного материала используют смыв 3-суточной культурыдрожжей из расчета 10 мл стерильнойводы на 1 пробирку с посевной культурой и 10 мл суспензии используютдля засева 100 мл ферментолизата.Дрожжи выращивают на круговойкачалке 200 об/мин при 28 С в тече"ние 1,5"2 оут, после чего суспензиюцентрифугируют, а в культуральной жидкости контролируют содержание редуцирующих веществ и хроматографически состав углеводов (фиг, 5 б).,Выращивание на Ферментолизате дрожжей К. (ЗассЬ.) ГгаВ 11 хз снижает содержание глюкозы, арабинозы и ксилозы до следовых количеств. Неутилизируемой остается фракция целлодекстринов (Фиг. 5 б), Однако выращивание на Ферментолизате культуры Т.1 ьВпокцш приводит к усвоению целлодекстринов (фиг. 5 в), а также снижениюколичества редуцирующих веществ всреде,Культуральную жидкость с целлодекстринами стерилизуют при 1,5 атмв течение 30 мин, После охлажденияразливают в колбы Эрленмейера по100 мл и засевают каждую 10 мл суспензии спор гриба ТгхсЬойегша 11 япогцш ОМ 53 ч, Гриб культивируют в течение 3 сут до получения максимальнойактивности целлюлазы 1,5-2,0 ед. Динамика синтеза целлюлазы Т. 13.япогцшОИ 534 на среде с целлодекстринами показана на Фиг. 4. Биомассу гриба, несодержащую нерастворимого субстрата,отфильтровываот, а часть культуральной жидкости (целлюлазы) используютдля получения новой порции Ферментолизата. При этом цикл повторяется.Формула изо бре те нияСпособ получения целлюлазы, включающий приготовление питательной среды для гриба - продуцента целлюлазы, глубинное культивирование на питательной среде, содержащей источ- ник целлюлозы, подвергнутый гидролизу, гриба - продуцента целлюлазы рода Тк 3. - сЬойегша н дроюкей ЗассЬакошусев, о тличающий ся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа и улучшения качества конечного продукта, при приготовлении питательной среды для гриба - нродуцента целлюлазы источник целлюлозы подвергают Ферментативному гидролизу с помощью целлюлазы, в полученном ферментолизате инактивируют целлюлазы.прогреванием и осуществляют последовательное глубинное культивирование дрожжей и гриба - продуцента целлюлаз, причем дрожжи культивируют до полного истощения в культуральной среде моносахаридов, удаляют их и культивируют на полученной. Дерба едакт и ГКНТ "МСВ Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 10 Ю, бО ЖМОИЗОО уО гказ 997 ТирНИИПИ Государственного113035,аж 367 Подписное комитета по изобретениям и открытия Иосква Ж, Раушская наб., д. 4/5