Фаговый вектор замещения к15 для конструирования библиотек структурных генов к днк

(5)5 С 12 К 15 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ретение отно ности к генет бретения яв нове фага Л 1,экспресси сирующих в эффектив нос ную и одноцеп чается в том ют за 1 ф которую встрится к биотехнолоической инженерии, яется создание векочетающего свойструющих, так и кторов, а также пои перевода вставки очечную формы, Спочто в вектор АЯК 9 рагмент плазмиды оен Нпс- фрагОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(72) Е.Р.Забаровс кий, Е. Г,Загорскаяи Л.Х.Киселев53) 575,224,2:577.2(048) (088.8)56) Нап Т,НЙЦИег И/.Т, йцс. Ассз, Вез.1987, Ч.15, р. 6304.Нап Т,НЯТгатоща С, йииег чч,Т,Вос)еазтгу, 1987, Ч,26, р. 1617-1625,ф 4) ФАГОВЫЙ ВЕКТОР ЗАМЕЩЕНИЯ ЛЯК5 ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИБЛИОТЕКСТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ кДНК Изобретение относится к биотехни, в частности к генетической инжене Целью изобретения является уменьшение затрат труда и ускорение генно- инженерных процедур для получения репрезентативных библиотек структурных генов КДН К) и их дальнейшего использования.ЖК 15 - фаговый вектор для конструирования библиотек структурных генов (кДНК) по участкам узнавания рестриктаз Ваа 1 и Есой 1. Вектор можно также использовать для специального клонирования генов. Размер ЖК 15 около 51,2 т.п.н. Емкость вектора от 0,2 до 15,4 т,п.н. ЯК 15 состоит из ДНК фага АЯК 9, в который введен инактивированный ген устойчивости к канамицину, выщепленный рестриктазой за 1 из плазмиды рИС 4 К Чгга Мезз п 9 ., бепе, 1982, ч. 19, р. 259 - 268) размер "1,5 т.п.н., со встроенным в него участком ДНК фага А размером Ы 2 1650699 А 1(57) Изоб гии, в част Целью изо тора на ос ва как неэкспрес вышение в плазмид соб заклю встраива риС 4 К, в мент фага-2,0 т.п,н. выщепляемый рестриктазой Нпб(23130 н, - 25157 н.).Хозяевами могут служить штаммы Е. со, используемые при работе с Аце 11, АЕМВ 1 3;12 АР, рИС 18, ар 18 и др., в том а числе:Е 392 = Е, )здй 514 (г, а,), ыр Е О 44, зир Е 58, ас У 102(ас 12.У) 6,9 а К 2 оа (Я Т 22, ает. В 1, тгр Я 55; В 359 = ) зс К, ) зб М, зор Г, Ф 80, Р 2. Этот вектор обладает максимальной, известной для векторов этого класса емкостью и позволяет получать библиотеки кДНК как по стандартному методу, О так и с использованием частичной достройки липких концов без применения метилаз. АЯК 15 дает возможность перевода вставки а в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от 2 АР. Применение этого метода позволяет перевести вставку в плазмидную форму быстрее (3 - 4 ч), и кроме того, перевод происходит значительно эффективнее и стабильнее, Для библиотек вЯБК 15 гарантированы невозможность неконтролируемого перевода вставки кДНК в фаге л. в одноцепочечную форму. Вектор дает воэможность проводить селекцию в пользу истинно рекомбинантных фагов перед исходными и "фальшивыми" рекомбинантами, В библиотеках, полученных вл 5 К 15, легко оценить процент рекомбинантных фагов по фенотипу. Селективное давление при конструировании в нем библиотек кДНК направлено в отличие от других векторов не в сторону маленьких вставок, а, наоборот, в сторону крупных (2 - 8 т.п.н,). кДНК в этом векторе может быть экспрессирована, причем трансляция может проходить в строго контролируемых условиях при наличии в штамме Е. сомутации вор С или зцр О, вор Ч, зцр В.Способ конструирования вектора л 5 К 15 заключается во введении в фаг 5 К 9 фрагмента ДНК размером 3,5 т,п,н., состоящего из инактивированного гена устойчивости к канамицину из рОС 4 К со встроенным в него участком ДНК фага А (участок 23130 - 25157 н.).Стадия 1. Получение плаэмиды р 4 К 4-1 ДНК плазмиды рОС 4 К гидролизуют рестриктаэой Нпб И и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65 С, Затем ДНК фага А расщепляют также Нпб И и фрагмент размером 2,0 т,п.н. очищают гель-электрофорезом в 0,7;ь-ной легкоплавкой агарозе (здгпа). Очищенный фрагмент смешивают в эквимолярных концентрациях рОС 4 К, разрезанной Н 1 пб 1 И, и лигируют. Лигированной ДНК трансформируют клетки Е. соИ штамм).М.109, которые высевают на-агар с антибиотиком - ампициллином, С выросших колоний снимают отпечаток на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченой Р ДНК фага Я. Из шести гибридизующихся колоний клетки наращивают в 10 мл-среды с ампициллином и выделяют ДНК щелочным лизисом.0,5 мкг ДНК расщепляют рестриктазами Есой 1, Ваа 1, за 1, Нпб И 1 и анализируют электрофорезом в 1%-ном агароэном геле, Одна из плазмид обладает прогнозируемой рестриктазной картой, одну из них, названную р 4 К 1:1, используют на следующей стадии,Стадия 2. Конструирование фага Я 95 К 5. ДНК плазмиды р 4 К.-1 гидролизуют ре. стриктаэами Есой 1 и ва 1 и реакцию останавливают прогреванием 15 мин, при 65 С, ДНК фага А 9 Е 7 расщепляют рестриктазой ва 1 и фермент инактивируют прогреванием 15 мин при 65 С. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют. Лигированную ДНК упаковывают в белки5 10 15 20 фага и и 1 го и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е.со штаммЕ 392. С чашки Петри снимают отпечаток на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченым Р фрагментом ДНКзгрОС 4 К, содержащим ген устойчивости к канамицину и выщепленным иэ плазмиды рестриктазой за 1. Из шести гибридизующихся бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз Есой 1, Вала 1 и за 1. Все фаги содержат инактивированный ген устойчивости к канамицину и один из них (Я 9 ЯК 5) используют для конструирования АЯК 15.Стадия 3. Конструирование фага-вектора 5 К 15,ДНК фага АЕМВ 1 3 гидролизуют рестриктазой Вагп 1 и вставочный фрагмент размером около 13,7 т.п,н, очищают гельэлектрофорезом в 0,77-ной легкоплавкойагарозе. ДНК фага 1 ЯК 5 гидролизуют рестриктазой Вагл 1 и фермент инактивируют прогреванием 15 мин при 65 ОС. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют. Лигированную ДНК упаковывают 1 п чИго в белки фага и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е. со 1 штаммЕ 392. Выросшие бляшки перекалывают на газон клеток 0 30 359, лизогенных по фагу Р 2. Вставочныйфрагмент из л. ЕМВ 3 обеспечивает зр 1 фенотип, т.е, невозможность размножаться на клеткахЕ, со 1, лизогенных по фагу Р 2, Поэтому из шести бляшек, не выросших на 35 0 359, наращивают фаг, выделяют ДНК ианализируют с помощью рестриктаз Есой 1, Вае 1 и за 11, Два из них имеют ожидаемую структуру и названы ЛЯК 15 А и 5 К 15 В,Применение А 5 К 15. Фаг вектор АЗК 15 40 используют для получения библиотек кДНКпо стандартной методике с использованием Есой 1 - участка, Для элиминации нерекомбинантных и "фальшивых" рекомбинантов рассевают фаги на газон Е, со 0 359, по скольку ни исходные, ни фаги, содержащиевставку, соединенную с линкером, не будут размножаться на этих клетках. Фаги, образованные соединением "плечей" л 5 К 15 с линкеромами), нежизнеспособны из-за ма лой длины ДНК на любых штаммах Е, со 1.Минимальный ргэмер ДНК, способной давать жизнеспособные частицы фага, 37,7 т,п,н., а размер плечей ЯЯК 15 37,5, т,е. меньше минимального на 0,2 т.п,н., причем яс но, что встраивание даже многих копийлинкеров не приведет к существенному изменению длины ДН К и образованию жизнеспособных "фальшивых" рекомбинантов.При этом будет также практически исключе 1 б 50 б 99но образование частичных рекомбинантов, т.е, фагов, содержащих как исходную вставку, так и вставку кДНК, так как размер ЯЗК 15(около 51,2 т.п.н.) близок к максимальному для фага л, (около 52,9 т,п,н,), Эффективность этого метода повышается, если предварительно очистить "плечи" 5 К 15 электрофорезом или центрифугированием от вставочного фрагмента, Для конструирования библиотек кДНК по Есой 1 участку используют ЯЗК 15 не в виде А фага, а в виде дифазмиды, содержащей только "плечи" 35 К 15 и поэтому не способной к эффективной упаковке в белки фага л, из-за недостаточной длины, Для получения дифазмиды расщепляют ДНК 5 К 15 рестриктазой Есой 1 и проводят самолигирование при низкой концентрации ДНК, обеспечивающей образование в основном кольцевых, а не конкатемерных форм, Этой ДНК трансформируют клетки Е. со, не дающие вазможности проходить полный лигический цикл фагу л,(например, штамм НВ 101), Очевидна, что при конструировании библиотеки генов в этой дифазмиде все жизнеспособные фаги будут рекомбинантными. В этой форме АЗК 15 напоминает векторы-фазмидь Л рМУР 131 и Л рЯ 51.Однако более удобно использовать ЛЗК 15 для конструирования библиотек кДНК с использованием Вагп 1 участка. Двуцепочечную ДНК синтезируют по обычной методике, однако обрабатывают не ЕсоР 1, а Вагп 1 метилазой (или гагп-метилазой), Затек к ней пришивают Багп 1-линкеры и обрабатывают рестриктазой Вагп 1 (лли МЬо ). ДНК АЯК 15 гидролизуют одновременно рестриктазами Вагп 1 и Есой 1, После остановки реакции прогреванием 15 мин при 65 С проводят очистку от олигонуклеатидных линкеров Вагп 1 - Есой 1 осакдением ПЭГ. В результате "плечи" содержат липкие концы Вагп 1, а вставочный фрагмент - Есой 1 и, таким образом, образование исходного фага при лигировании возможно только за счет остаточных линкеров Вагп 1 - Есой 1, причем эта реакция более высокого порядка, чем образование рекомбинантного фага. Поэтому приполучении библиотеки кДН К по этому методу опускают пассирование библистеки на Е, соИ 0 359. Ясно, что и в этом случае "фальшивые" рекомбинанты нежизнеспособны.Использование участка Вагп 1 в ЯЗК 15 для получения библиотек кДНК позволяет объединить преимущества двух методик - с использованием техники частичной достройки липких концов и конструирование библиотек без применения метилаз, К кДНК 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пришиваются линкерь; за 1 (или Х 1 а 1) без предварительной обработки метилазай. Г 1 аскольку рестриктаза зз 1 щепит эукариатическую ДНК редко (один участок узнавания на 50 т.п,н.) и преимущественно в регуляторных областях, которые не представлены в кДНК, то последующий гидролиз кДНК рестриктазой за 1 не приведет к существенному изменению размеров кДНК. После инактивации фермента проводят в соответствующей инкубационной среде частичную достройку липких концов ДНК фрагментом Кленова (или ревертазой) в присутствии г СТР и 0 ТТР. ДНК 15 К 15 гидрализуют рестриктазами Есой 1 и Вап 1 1 и затем проводят частичную достройку липких концов ДНК с помощью фрагмента Кленова или ревертазы в присутствии г АТР и а ОТР. Оба препарата смешиваю 1 и лигируют, причем лигирование в данком случае макег талька в одном направлении: кДНК лигнауегся с векторной ДНК, так как самолигиравание и векторной, и кДНК невозможна. Исгальзуя стандартные методы, лигираванную ДНК упаковывают п юсга а белки фага . и полученными фагавыми частицами заражают клетки Е. са штамм Е 392. Сравнение этой методики с конструированием библиотек кДНК с использованием частичной дагтрайки липких кацав в других векторах (.15 К 11, ЫК 12, дт 18/19 .дт 22, ЛИАР) позволяет сделать вывод, что.5 К 15 наиболее удобен из них,Синтез специального линкера позволяет обойтись без метилиравания кДН К и ее дальнейшего гидрализа рестриктазай, чта еще больше облегчает конструирование библиотеки, Особенно эта удобно при использовании последней схемы, поскольку отпадает необходимость: астичной достройки липких концов,В лВК 5 можно конструировать и "направленные" библиотеки кДНК с использованием двух рестриктаз (пары Есой 1 - ХЬа 1, вас 1 - Вагп 1 и др,Экспрессию кДНК в л 5 К 15 осуществляют также, как и в других векторах с использованием ас-промотара (у 11, Ы К 11, ЕЛР ит.д,), однако эффективная трансляция этой мРНК может асуществлятьсч талька в строго контролируемых условиях при наличии (или введении плазмиды, несущей соответ. ствующий ген) в клетках Е, со мутации вцр С и/или зцр О, вор В, вар Ч, Это связано с тем, что через 6 триплетов после инициирующего кодона АУ 6 встроен термлнирующий кодон УАА (охра), действие коараго супрессируется мутациями ыр С, вар б, вор Ч, зцр В. Таким образом, конструированиебиблиотеки кДНК в Ж 5 К 15 позволяет избежать неконтролируемой экспрессии кДНК, что приводит к повышению репрезентативности этой библиотеки, СледовательноЛК 15 представляет собой в этом отношении новый тип векторов для получения библиотек структурных генов кДН К, поскольку в зависимости от используемого штамма Е. соИ ои мажет быть как экспрессирующим,так и не экспрессирующим и поэтому объединяет достоинства обоих видов векторов. При конструировании библиотеки кДНК в 5 К 15 можно осуществлять и неконтролируемую экспрессию, как в других экспрессирующих векторах. Дпя этого достаточно в линкер, присоединяемый к кДНК, ввести кодаи АТ 6. При этом транслируемый белок практически лишен дополнительных, чужеродных аминокислот.Вставка кДНК вЯЯК 15 может быть легко переведена в плазмидную форму, При этом используется иной принцип, чем в АЛЛАР, ДНК рекомбиианта,ЬК 12 частично гидролизуют рестриктазой за 1 можно применять также Са 1) и инактивируют фермент ,трехкратным замораживанием/оттаиванием. Обе рестриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК, причем эти участки сосредоточены в основном в регуляторных областях, которые отсутствуют в кДНК. Затем ДНК разбавляют и самолигируют. Лигироваиную ДНК вводят в компетентные клетки Е, соИ, которые высевают на 1:агар с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку кДНК в плазмидиой форме, причем плазмида либо вовсе не содеркит нуклеотидных последовательностей фага 1 (в случае за 1), либо небольшую их часть в случае Са 1). Процесс перевода в плазмидную форму быстр 3 - 4 ч) и эффективен, 0,1 мкг ДНК рекомбинанта дает много сотен и тысяч колоний, При необходимости для специальных экспериментов как фаг 5 К 15, так и его рекамбиианты, могут бытьпереведены в плазмидную форму и по другому методу, В этом случае достаточно адсорбировать фаг на клетках- Е.со 1, резистентных к размножению фага А(например, НВ 101, .М,109, С 359) в течение 5 - 10 мин при 0 - 37"С и рассеять клетки на газон с ампициллииом. В этом случае, однако, плазмида содержит и все нуклеотидные последовательности фага А, присутствующие в ЯК 12. С другой стороны, такая ппазмида может быть легко переведена в форму фага А, что может быть полезно для специальных целей.5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 При супериифекции клеток Е.соИ, содержащих плазмиду, фагом М 13 ДНК плазмиды упаковывают в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секвенироваиия по известному методу Сэнгера. Другое преимущество 5 К 15, связанное с тем, что это вектор замещения, заключается в том, что при конструировании в нем библиотек кДНК давление отбора направлено на клонирование более крупных вставок кДНК (2 - 8 т,п.и,), а ие мелких, как во всех других векторах зтога класса, являющихся векторами включения, Емкость Л 5 К 15 - до 15,4 т,п,нчто достаточно для клонирования полных копий мРГК практически всех генов,Процент рекомбинантов в библиотеке, полученной в ЫК 15, легко определить по фенотипу, перекапывая бляшки на газон 0 359 или используя двойной газонЕ 392 И 359, При перекапывании на газон 0 359 не рекомбинант иые фаги не размножаются, а рекомбинантные размножаются, Однако перекалывание довольно трудоемкий процесс, а прямой посев фагов на газон О 359 может привести к артефактным результатам, Разработанная нами техника двойного газона позволяет преодолеть эти недостатки. В этом случае анализируемые фаги инкубируют с клетками Е. соИ штаммЕ 392 и после добавления О,б -ного-агара высевают на чашки Петри. Поверх этого газона высевают газон клеток 0 359 также в 0,6 -нам 1-агаре. При этом рекомбинантные фаги дают прозрачные бляшки, а не рекомбинантные - мутные, что легко детектируется визуально,Таким образом, фаг 5 К 14 - единственный вектор замещения, который можно использовать для конструирования библиотек кДН К.Основные достоинства этога вектора заключаются в вазмокности получения библиотек как по стандартным, так и по новым методикам, в том числе, с использованием частичной достройки липких концов и без применения метилаз, возможности испольэовать для клонирования рестриктазу Вапт 1, обьединяет достоинства экспрессирующих и не экспрессирующих векторов и может быть использован в зависимости от штамма Е. соИ как в виде экспрессирующего, так и в виде не экспрессирующего, фенотипическом определении доли рекомбинантных фагов, минимальной до 15,4 т,п,н.) емкости среди векторов этога класса; возможности биохимической и генетической селекции против исходных, не рекомбинантных фагов, наличии эффективного механизма элиминации как "фальшивых".1650699 1 О Составитель С.БандринТехред М.Моргентал Корректор Т.Малец Редактор Н,Гунько Заказ 1584 Тираж 385 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 так и частичных рекомбинантов, возможности быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму,свободную от "плечей" фага, воэможностиперевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры по методуСзнгера, гарантированности невозможности неконтролируемого перевода вставкикДНК в фагеЖК 15 в одноцепочечную форму, возможности специфического мечениякак 5-, так и 3-концов вставки кДНК с использованием стандартных, коммерческидоступных препаратов затравок,П р и м ер 2. Клонирование в ЯЯК 15фрагментов геномной ДНК человека,3 мкг ДНК человека расщепляют рестриктазой Вагп 1 в стандартных условиях иинактивируют фермент прогреванием 15мин при 65 С, 3 мкг ДНКЯЗК 9 гидролизуютрестриктазами Вал 1 и Есор 1 и инактивируют ферменты прогреванием и очищают отолигонуклеотидных линкеров осаждениемПЭГ.Оба препарата смешивают весовое соотношение ДНК вектора и геномной ДНК2:1) и проводят лигирование при суммарнойконцентрации ДНК 250 мкг/мл, 1 10 мкглигированной ДНК упаковывают в белки фага и ч 1 го и 1/500 полученных фаговых частиц рассевают на газон Е, со штаммЕ 329.Г 3 ри переколе 50 бляшек на газон 0 359только одна из них не выросла, таким образом, рекомбинантные фаги составляют свыше 95;ь.Из шести случайно отобранных бляшекс газона .Е 392 в 10 мл-среды сЕ 392 быливыращены фаги и выделена из них ДНК.Электрофоретический анализ ДН К показал,что все они рекомбинанты и содержат вставку ДНК от 4 до 7 т.п.н. 0,5 мкг ДНК одного иэ них (М 1) гидролиэуют в течение 30 мин 1 ед, рестриктазы за , Фермент инактивируют трехкратным эамораживанием/оттаиванием. ДНК разводят и лигируют при 5 комнатной температуре в течение 1 ч.0,1 мкг лигированной ДНК добавляют к компетентным клеткам Е. соП штамм ,М,109, инкубируют 10 мин, при 0 С, затем 5 мин при 38 С и.после добавления 1 мл-среды 10 еще 45 мин при 37 С, Затем 0,2 мл клеток рассевают на-агар с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл :среды с ампициллином (50 мкгlмл) наращивают клетки и выделяют ДНК щелочным 15 лизисом. Электрофоретический анализ ДНКпоказывает, что плаэмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг М 1,Формула изобретения 20 Фаговый вектор замещения 35 К 15 дляконструирования библиотек структурных генов кДНК размером 51,2 т,п.н., содержащий ДНК фага ЯЯК 9 размером 47,7 т.п.н.; за 1 - фрагмент плазмиды рИС 4 К размером 25 1,5 т.п.н.; встроенный в за 1 участок размером 20,3 т.п.н. ДНК фагаМЗК 9; Нпб - фрагмент фага л, размером 2,023 т.п.н.(23130 н, - 25157 н.); встроенный в Нпбучасток за 1 - фрагмент плаэмиды рИС 4 К;30 места вставки чужеродного фрагментаЕсой 1 и Ващ Н 1; емкость вектора 0,2- 15,4 т.п.нспектр хозяев; хозяевами могут служить штаммы Е. со, используемые при работе с Ьрт 11 лЕМВ 1 3, Ж."АР, рИС 18, 35 ар 18 и др., в том числе;Е 392 = Р, Ьзб В 514 г, пъ), Мр Е 44,зцр Р 58, ас У 1 ОЛ Рас 17 У) 6, да К 2, 9 а Т 22, вел В 1, игр В 55. 0 359 = Изб й, Мб М, ЗКр Е, Ф 30, Р 2.40