Способ получения молибдокофактора

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ЯО 152 О А ПИСАН ИЗОБРЕИДЕТЕЛЬСТВ ТЕ ТОР СКОМУ МОЛИБДОКОФАК те сится пособ получе), и момологии- упро- либдоко- целев эн ретени ния мо то я к биотехнобам получео-ко) и можетимологии, в упро и по пре та. выд пшенленинцы, Отво буферн елков,ромщих нный а экстрак одер связанный Моэкстракт обе о,аз и оливают для отделени ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ" СССР(71) Институт молекулярной биологиии биохимии АН КазСССР(57) Изобретение отннологии, а именно кния молибдокофакторжет быть использовани медицине. Цель изобщение процесса получфактора и повышение Изобретение относитлогии, а именно к спосйия молибдокофактора (быть использовано в энмедицине.Цель изобретения -цесса получения Мо-кочистоты целевого продуСпособ заключаетсяМо-ко из отрубей зернаб обрабатывают 51)4 С 12 Х 11/00 С 07 В 475/О вого продукта, Способ заключается ввыделении молибдокофактора непосредственно из экстракта отрубей зеренпшеницы; Отруби экстрагируют буферным раствором, экстракт обессоливаютдля отделения низкомолекулярныхтиолсодержащих соединений и обрабатывают мочевиной или додецилсульфатом натрия для денатурации белков иотделения Мо-ко. Мо-ко адсорбируютна тиолсефарозе, а элюцию проводят2-меркаптоэтанолом, который затемотделяют упариванием. Полученныйпрепарат Мо-ко гомогенен при тонкослойной хроматографии, что свидетельствует о высокой степени егочистоты, Упрощение процесса в основном заключается в том, что выделениеМо-ко осуществляется непосредственноиз экстракта отрубей, а не из предварительно очищенного препарата белка (или фермента), содержащего Мо-ко. низкомолекулярных соединений, способных связываться с тиолсефарозой. 1,ф Содержащиеся в экстракте белки обрабатывают 8 М мочевиной или 1 Е-ным додецилсульфатом натрия для отщепления Мо-ко и переведения его в растворимое состояние, Затем проводят связывание Мо-ко на тиолсефароз цию целевого продукта 2-меркаптоэтанолом. В предлагаемом способеотсутствует процедура выделенияочищенного препарата белка, содежащего Мо-ко, так как выделениеМо-ко проводится из практически1520097 10 15 20 25 30 35 40 45 50 очищенной смеси различных белков,что существенно упрощает процесс,очистки Мо-ко. Замена прогреванияна обработку денатурирующими реагентами позволяет избежать измененийМо-ко и образования неактивных формэтого вещества, что в конечном итоге увеличивает чистоту целевого продукта. Проведение элюции 2-меркаптоэтанолом, который в отличие отиспользовавшегося ранее глутатионаможет быть легко отделен упариванием, также повышает чистоту целевогопродукта,П р и м е р. 20 г отрубей зерна пшеницы смешивают с 100 мл 100 мМИа-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 М ИаС 1,1 мМ аскорбиновой кислоты. Эту суспензию центрифугируют при 1200 я втечение 10 мин на холоде (4 С) . Супернатант пропускают через сефадексС(или С) для удаления низкомолекулярных тиолсодержащих соединений экстракта, которые также могутсвязаться с сефарозой. В белковыйпик экстракта добавляют мочевинудо 8 М или ЗРЯ до 1 Е для денатурациибелковой молекулы и выхода Мо-ко враствор, Результаты, полученные прииспользовании двух денатуратов, идентичны.г сухого геля тиолсефарозы 4 В(2 х 30 см), который перед диализомсплющивают в ленту, чтобы максимальное количество гранул тиолсефарозысоприкасалось с мембраной. Это позволяет достичь наибольшего доступа,кофактора, проникающего через мембрану к всем гранулам сефарозы, Затем целлофановый мешок с тиолсефарозой помещают в раствор источникаМо-ко (экстракт отрубей),Сосуд с раствором, где проводитсядиализ, тщательно дегазируют и заполняют азотом. Диалиэ проводят дополного насыщения сефарозы кофактором, периодически обновляя источникИо-ко (через каждые 30 мин) .Насьпцение сефарозы определяют следующим образом. Кроме большого целлофанового мешка в раствор источника Мо-ко помещают 10-15 маленьких меФшочков с тиолсефарозой и через определенные промежутки времени (3045 мин) снимают их по одному, элюируют Мо-ко 2-меркаптоэтанолом.Полное связывание Мо-ко с тиолсефарозой подтверждается отсутствием следов 2-тиопиридина при последующей элюции связанного кофактора 2-меркаптоэтанолом. Содержание 2-тиопиридина контролируется спектрофотометрически при длине волны 343 нм.Сефароза насьнцается полностью в течение 2,5-3 ч диализа. Во время диализа экстракт отрубей обновляется свежими порциями через каждые 30- 45 мин, так как отделяющийся от белка Мо-ко, не достигнув сефарозы, инактивируется в условиях диализа (т.е. при комнатной температуре) .Связывание протекает с одинаковой эффективностью в аэробных и анаэробных условиях. После насыщения кофактором сефарозу промывают несколько раз указанным буфером, содержащим 1 М ЯаС 1. Затем тщательно промывают дистиллированной водой.Иммобилизованный на тиолсефарозе Мо-ко сохраняет 90% активности по отношению к исходному в течение 2 мес тогда как препарат Мо-ко в растворе д(в буфере) инактивируется полностью в течение 10-12 ч даже в анаэробных.условиях. Лиофильное высушивание сефарозы с иммобилизованным кофактором и хранение на холодео(4 С) позволяют сохранить активный Мо"ко до 1,5 лет.Элюция Мо-ко с тиолсефарозой осуществляется 2-меркаптоэтанопом, причем последний легко отделяется от Мо-ко упариванием.Полученный препарат Мо-ко гомогенен по данным тонкослойной хроматографии в различных условиях, причем значения К 1 у полученного предлагаемым и известным способами Мо-ко идентичны. Содержание сульфогидрильных групп, фосфата, а также флуоресцентные характеристики полученного Мо-ко не отличаются от соответствующих характеристик известного.Мо-ко. Эти данные свидетельствуют, что выделенное органическое соединение яв 55 ляется Ио-ко, представляющим собой производное птерина, содержащее двесульфогидрильные и одну фосфатнуюгруппы.Формула из обретенияСпособ получения молибдокофактора, включающий обработку исходного сырья, содержащего связанный с белками молибдокофактор, отщепление моСоставитель В.МуронецРедактор И.Дербак Техред М,Ходанич Корректор А.Обручар Заказ 6723/29 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101 5 152Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс выделения Мо-ко за счет исключения стадий выделения белков, содержащих Мо-ко, и стадий дополнительной очистки Мо-ко, а также получить препарат, не содержащий неактивных продуктов деградации Мо-ко и глутатиона. 0097 6либдокофактора от белков, его связывание с тиолсефарозой и элюцию целевого продукта тиолсодержащими соединениями, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта, в качестве исходного сырья используют пшеничные отруби, которые 10 обрабатывают буферным раствором иполученный экстракт обессоливают, отщепление молибдокофактора от белков осуществляют обработкой додецилсульфатом натрия или мочевиной, а элюцию целевого продукта проводят раствором 2-меркаптоэтанола.