Сырье для получения молибдокофактора

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 18061 Р 9/00, С 12 й 9/00 ЕТЕН ИЕ ИЗОБ ПИС ПАТЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СЫРЬЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛИБДОКОФАКТОРА Изобретение относится к биохимии, а именно к получению молибдокофактора,Молибдокофактор (Мо-со) представляет собой 6-замещенный птерин в тетрэгидроформе, связанный с молибденом и, возможно, с пептидом. Может быть использован в научных исследованиях для установления структуры и свойств Мо-со, а также молибдоферментов (Мо-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиноксидаза, ксантиндегидрогенаэа, эльдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со, Последний может также быть использован при диагностике и лечении ряда неврологических и урологических заболеваний, связанных с недостатком и нарушениями биосинтеза Мо-соНаиболее ра ся выделение Мо-со ь(57)Использование: изобретение может быть использовано в научных исследованиях для установления структуры и свойств молибдокофактора (Мо-со), а также молибдоферментов (Мо-ферментов) (нитрэтредуктаза, ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со. Последний может также быть использован при диагностике и лечении наследственных заболева,ний, связанных с отсутствием в печени больных Мо-ферментов. Сущность изобретения: предлагается в качестве сырья для получения молибдокофактора использовать семена гороха, которые содержат молибдокофактор как в свободной, так и в связанной с белком форме, 1 табл,ных тканей, клеток микроорганизмов, которые содеркат Мо-ферменты. При этом для получения кофактора необходимо сначала выделить и очистить Мо-фермент, а затем из фермента выделить кофактор. Известно также использование зерна пшеницы в качестве сырья для получения Мо-со, Содержание Мо-со в семенах пшеницы, определенное по восстановлению активности дефектной по Мо-со нитратредуктазы мутанта гриба Мецгозрога сгазза итсоответствует 17,2 нмолей МО 2 - образованных за 1 минуту на 1 г воздушно сухой массы семян, При использовании зерна пшеницы в качестве источника для получения Мо-со необходима стадия отделения отрубей от зндосперма, что усложняет процесс получения кофактора. Кроме того в зерне пшеницы Мо-со обнаружен только в форме, связанной с белком, что также требует дополни1806197 Содержание молибдокофактора в семенах гороха и пшеницы тельной стадии при выделении, а именноприменения денатурирующих агентов, тепловой или кислотной обработки исходногопрепарата,Цель изобретения - увеличение выхода 5Мо-со и упрощение процесса его получения,Сущность изобретения заключается втом, что в качестве сырья для полученияМо-со используют семена гороха, содержание Мо-сов котсрых в среднем в 10 раз, адля 10отдельных генотипов семян гороха в 20-30раз выше, чем в зерне пшеницы, Кроме того,в семенах гороха Мо-со присутствует как в. связанной с белком, так и в свободной форме,при этом содержание свободного Мо-со у ряда генотипов (таблица) превышает количество кофактора в связанной форме.П р и м е р. 5 г семян каждого генотипаизмельчают до состояния муки. Затем навеску муки 0,5 г экстрагируют в 2,5 мл 50 мМ 20калий-фосфатного буфера, рН 7;4 с добавками йа-ЭДТА (1 мМ) и восстановленного глутатиона (3 мМ). Экстракцию проводят втечение 60 минут при перемешивании на. магнитной мешалке при температуре 5 С.После этого экстракт центрифугируют при13000 х д в течение 40 минут. Супернатантиспользуют для определения содержаниясвободного и связанного Мо-со.Процедура определения связанного 30Мо-со включает следующие две стадии: 1 -освобождение кофактора от белка, 2 - комплиментация освобожденного Мо-со апонитратредуктазой экстракта мутанта ит гриба йецгозрога сгазза, дефектной по Мосо и определение активности вновь образовавшейся и чтго нитратредуктазы. Дляосвобождения Мо-со экстракты подвергаюттепловому шоку (прогревание на водянойбане 70 С в течение 90 секунд). Прогревание проводят в смеси, содержащей в объеме60 мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН7,4 с добавками - 1 мМ йа-ЭДТА и 3 мМвосстановленного глутатиона, При определении содержания свободного Мо-со для 45комплиментации используют экстракт безпрогревания. Комплиментацию Мо-со с экстрактом мутанта гриба йецгозрога сгазза иИ проводят следующим образом: к 60 мкл экстракта добавляют 120 мкл смеси, состоящей из экстракта йецгозрога сгазза пй(80 мкл), раствора йАОРН -2 х 10 М (20 мкл), раствора йа 2 Мо 04 0,1 М (20 мкл) и оставляют на 20 часов при 5 С. Активность вновь образовавшейся и чтго нитратредуктазы определяют добавлением к комплиментационной смеси 100 мкл раствора РАО (10 4 М) и 100 мкл раствора йайОз (0,1 М) и инкубируют 40 минут на водяной бане (20 С). Для остановки реакции и удаления избытка йАОРН пробы кипятят на водяной бане в течение 15 минут, Затем смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют реагенты для определения нитритов: 0,5 мл раствора сульфаниловой кислоты (6 г кислоты в 1 л 20 соляной кислоты) и 0,5 мл раствора й-нафтилэтилендиамина солянокислого (1,23 г в 1 л дистиллированной воды), Спустя 15 минут, необходимо для развития окраски, количество образовавшихся нитридов определяют спектрофотометрически при длине волны 548 нм. Содержание Мо-со выражают в нмолях нитридов, образовавшихся за 1 минуту в.расчете на 1 г воздушно-сухой массы семян. Аналитическая повторность всех анализов трехкратная, биологическая - двухкратная.Мутант гриба йецгозрога сгазза пМ выращивают на среде Фриза. Результаты определений представлены в таблице,Таким образом семена гороха содержат в среднем в 10 раз, а отдельные генотипы в 20-30 раз больше Мо-со, чем семена пшеницы, при этом многие сорта гороха содержат Мо-со преимущественно в свободной форме, что значительно упрощает процесс выделения. Выход целевого продукта при использовании в качестве сырья для его получения семян гороха значительно возрастает, а себестоимость снижается.Формула изобретения: Применение семян гороха в качестве сырья для получения молибдокофактора.1806197 Продолжение таблицы Общее содержание молибдокофактораСо е жение молиб око акта а Генотип гороха сободный связанный Пшени а 17,2 0,0 17,2Примечание: единица измерения молибдокофактора - нмоли нитрита, образовавшегося за 1 мин в расчете на 1 г воздушно-сухой массы семян Составитель А, ШвецовТехред М.Моргентал Редактор 3, Ходакова Корректор Л, Филь Заказ 966 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 АистМалиновка85-23386-1485-237Таловец85-171ТуркусТруженикОрловчанинППС-1507ФлагманСмарагдНордЛ-84Тим 24,9 295,9 70,5 46,9 17,8 11,2 51,0 23,2 24,9 14,1 95 22,4 45,2 17,4 30,2 16,6 . 27,1 104,12,6 199,2 89,5 25,9 33,7 85,4 129,8 80,0 14,4 н. опр, 19,0 59,9 53,4 28,2 52,0 400,1 73,1 246,1 107,3 37,1 84,7 108,6 154,7 94,1 23,9 64,2 77,3 83,6 44,8