Способ определения тестостерона в биологической жидкости

БРЕТ НИЯ ДЕТЕЛЬСТВУ огичес обой с ому анализу и пре особ количественн ставляе го опре зобрете ления тестостерона ния - увеличение ч е т льностиоба, Дляперед сорббелком А скоре е и упрощен лимерный но ител обраба ог циеи ан Б. аш.еп ываю до насыщент испол ния, зуют олученныи ля твердо о анализа муносор фазного иммуноФерментнорона, Чувствите8 пг/млн Время естос ьность опр нализа 2 ч деления 40 мин. нн сится к иммунохиому анализу и к им лизу гормонов,Изобретение от и и иммунологиче нохимическому а тов ТСном (БС изобр ельно лич ения и, у Цель чувствиорение и упрощ оба.б определеуществляет ние спо Спося тестостерона следующим обра и ТС. ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР ОПИ САНИ А ВТОРСНОМУ 21) 4257770/28-14(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНАВ БИОЛОГИЧЕСКО ЖИДКОСТИ(57) Изобретение относится к иммуно В лунках планшетов из полистирола сорбируют белок А из раствора,со- держащего 5-15 мкг/мл этого белка, в течение 16-20 ч при 4 С или не менее 2 ч при 37 С, после этого инкубируют в лунках сыворотку к ТС. После удаления избытка антител вносят смесь исследуемой пробы с конъюгатом ТС и Фермента пероксидазы (ПХ), Далее вносят хромогенный субстрат для ПХ и измеряют оптическую плотность продукта пероксидазной реакции, величина которой пропорциональна концентраП р и м е р 1. Получение конъюгас бычьим сывороточным альбумиА) и с ПХ,Предварительно готовят ТС-(окарбоксиметилоксим) (ТС-ЗСМО) следующим образом, К 250 мл ТС и 250 мг аминоуксусной кислоты добавляют 30 мл 207, (об/об) водного раствора метанола и 20 мл 0,1 М водного раствора ацетата натрия. Суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, Затем добавляют еще 2,4 г. ацетата натрия до концентрации 1 М и леремешивают суспензию при нагревании до 60 С 1 ч, Добавляют дважды поо5 мл метанола при 60 С до получения прозрачного раствора и перемешивают 30 мин, Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь, затем упаривают под вакуумом вдвое, Образовавшуюся суспенэию разбавляют водой до 100 мл, подщелачивают до рН 8-9 0,1 н, гидроксидом калия до растворения осадка. Трижды экстрагируют3149757750 мл этилацетата. Экстракт упаривак 1 т досуха,Конъюгат ТС-ЗСМО-БСА получают методом смешения ангидридов, 19 мгТС-ЗСМО растворяют в 2 мл диоксана5Добавляют 20 мкл трет-бутиламина и1 О мкл изо-бутилхлоркарбоната и переешивают в течение 1 ч при 12-15 С.При помешивании добавляют к этомураствору раствор, содержащий 29 мгА, 3 мл дистиллированной воды,2 мкл 1 н. гидроксида калия по капл м в течение 20 мин, перемешивают3 ч при 0-4 С и диализируют противд сти 3 тлированной воды в течение ночиопри 12-15 С. Образовавшуюся смесьп 1 одщелачивают бикарбонатом натриядо РН 8-9, осадок отфильтровывают,доводят РН фильтрата до 3 концентри ОРЬванной соляной кислотой, образовавш 1 яйся осадок отбрасывают, используют надосадочную жидкость, Молярноесоотношение ТС - БСА в .конъюгатесоставляет 37:1. .25Для получения конъюгата ТС-ПХ используют метод смешения ангидридов.2 мг ТС-ЗСМО растворяют в 1 мп безводного диоксана, содержащего 2 мклЗ.н-бутиламина. При охлаждении до 305 9 С прибавляют 0,5 мл диоксана,содержащего 1 мкл изобутилхлоркарбонта, и перемешивают при температур замерзания диоксана 1 ч 15 мин.Этот раствор медленно добавляют порц ями по 50 мкл к охлажденному до4 С раствору 10 мг ПХ в. 3 мл 0,53-нег раствора бикарбоната натрия.Посл перемешивания 2,5 ч при 4 С провОдят дважды диализ против 1 л 400 01 н, калий фосфатного буфера,содержащего 0,1 н, хлорид натрия, РН 7,2(ФБ) в течение 2 ч и ночи при 4 -12 С. Молярное соотношение ТС-ПХ вкОнъюгате составляет 6:1.Получение гетероиммунной антиТС-сыворотки.Крольчих иммунизируют конъюгатомТ(."-ЗСМО - БСА трижды (раз в 2 неделй) внутримьппечно по 1 мг (в смесис полным адъювантом Фрейнда (1;1и трижды (раз в 6 недель) внутривенно по 0,8 мг на кролика (вес кролйков 2,5-3 кг), Реиммуниэацию провФдят через 9 месяцев путем двукратнОго внутривенного введения 0,8 мгтго же конъюгата, Кровь для получения сыворотки берут через 7-10 днейпосле последней иммунизации. Получение иммуносорбента.Иммуносорбентом служит гаммаглобулиновая фракция кроличьей гетеро- иммунной сыворотки к ТС, связанная с белком А, адсорбированным на планшете.Иммуносорбент готовят сорбцией белка А стафилококка (5 мкг/мл белка А в ФБ) в лунках 96-луночных планшетов по 100 мкл на лунку в течение 8 ч при 4 С. Эта и все последующие операции ИФА сопровождаются промывкой планшетов дважды водопроводной водой и дважды ФБ, содержащим 0,05% детергента тритон Хили твин(ТФБ).Затем в лунки планшетов добавляют по 100 мкл анти-ТС-сыворотки в разведении 1:1000 в тФБ, инкубируют в течение 2 ч при 37 С и отмывают ТФБ.Полученный иммуносорбент можето храниться до использования при 4 С в течение как минимум 4 мес (срок наблюдения), поэтому время его приготовления не лимитирует время анализа ТС.Проведение ИФА.Аликвоты плазмы человека.(0, мл) экстрагируют встряхиванием с 1 мл диэтилового эфира 10-15 мин, замораживают при (-1 О) - ("20) С, эфирную фракцию сливают и упаривают досухао нагреванием в водяной бане до 38-42 С. Сухой остаток растворяют в 0,1 мл ТФБ.В каждую лунку планшета с иммуносорбентом вносят 100 мкл образца (экстракта плазмы крови) или стандарта (разведения ТС в ТФБ с концентрацией от 50 нг/мл до 4 пг/мл) для построения калибровочной кривой и 100 мкл раствора конъюгата ТС-ПХ в ТФБ (концентрация 10 нг/мл по ПХ) и инкубируют 2 ч при 37 С.По окончании инкубации добавляют субстратную смесь (0,043-ный раствор о-фенилендиамина в.бидистиллированной воде, содержащей 0,0087. перекиси водорода) по 100 мкл на лунку. Через 30 мин (температура комнатная) останавливают реакцию добавлением 100 мкл 2 М серной кислоты и Регистрируют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при 490 нм,Пересчет оптической плотности продукта перексидазной реакции в концентрацию ТС проводят по калибровочному гРафикУ14975 7/ 6щих активные центры ГаЪ-фрагментов антител, связанных с белком А через Рс-фрагменты и имеющих большую подвижность, чем при многоточечном контакте молекул с поверхностью косителя при прямой адсорбции. Данный подход удобен методически и позволяет избегать выделения иммуноглобулинов путем осаждения, что, как правило, приводит к потере части антител,Время анализа 2 ч 40 мин. Чувствительность определения 8 пг/мл,СоставительВ,МитюшинТехред Л, Олийнык Корректор М.Максимишинец Редактор Л.Пчолинская Заказ 4439/47 Тираж 789 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 полученному при анализе стандартногопрепарата ТС.П р и м е р 2, Способ осуществляют согласно примеру 1 но концентраФ5ция белка А составляет 15 мкг/мл.Чувствительность и продолжительностьанализа та же, что и в примере 1.Предложенный способ иммуноферментного определения ТС обладает высокойчувствительностью 8 пг/мп (0,26 хх 10М), что в 8 раэ вьппе чувствительности, указанной в прототипе.Общая продолжительность анализа сос"тавляет 2 ч 40 мин, что меньше времени проведения всех известных способов иммуноферментного определенияТС,Положительным отличием предлагаемого способа является выделение гаммаглобулинов из сыворотки анти-ТСнепосредственно в лунках планшета спомощью аффинной адсорбции на белке А. Положительный эффект эа счетиспользования белка А предположительно обусловлен как пространственным разделением антител с носителем,так и энергетически выгодной длявзаимодействия с ТС ориентацией несуФормула изобретенияСпособ определения тестостерона в биологической жидкости путем обработки полимерного носителя антителами, инкубации исследуемой жидкости с конъюгатом тестостерона и фермента с последующим добавлением субстрата фермента и регистрацией содержания продукта ферментативной реакции по оптической плотности, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности,ускорения и упрощения способа, полимерный носитель предварительно обрабатывают белком А до насыщения,