Способ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани

)4 0 О 1 ВСЕСОСТЕНПЮ- Т БИБЛИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ НИЯ не, а в био зобре а именно кцентрациив тканях о изобретени я - увеличение ускорение спосоения экстракции нфосфата воднымпос,"едующей реги-. на флюориме ализа предла около 20 ми чувствительности иба путем осуществли гидролиза креатираствором НСХОстрацией креатинаОбщее время анспособом занимаетпрототипу 2 ч).Способ осущест тре.гаемымн (по яется следующи разом.Замороженную ань растирают в с жидким азотом, ткани заливают арфоровои ступке авеску растертой ОСУДАРСТЭЕККЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ РИ ПЮТ СССР(56) Попович М.И., Северин В.В.,Пыров В.Г, Энергетический метаболизми ультраструквура при аутоиммунойкардиогипопатии. ; Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,1986, с. 11, У 12, с. 671-.674.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯКРЕАТИНФОСФАТА И КРЕАТИНА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ,(57) Изобретение относится к медициние относится к медицине,способам определения кон- .реатинфосфата и креатинагаков человека и животименно к методам дпределениялогических объектах креатина и креатинфосфата, Целью способа является сокращение время анализа и поъышение чувствительности. Время анализа сокращается в 10 разчувст вительность способа 0,0014 мкМ по сравнению с 0,46 мкМ в прототипе.Способ осуществляется путем регистрации креатина до и после гидролиза креатинфосфата,причем гидролиз креатинфосФата осуществляют водным раствором НС 10+ в течении 2 мин при 100 С, а определение креатина проводят на Флюориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и Флюоресценции 480-510 нм. 1 табл. холодной (4 С) 0,5 М НС 10 (1 мп на40 мг ткани) и гомогенизируют в тече фние одной минуты в стеклянном гомо-генизаторе Поттера, Центрифугируют10 мин при 3000 об/мин. По 0,2 мл ффсупернатанта отбирают в две пробирки. вК содержимому первой пробирки добав- аляют О,1 мл 2 М КОН. Вторую пробиркупомещают на 2 мин в кипящую водянуюбаню для гицролиза креатинфосфата,после чего ее помещают на лед и ксодержимому добавляют 0,1 мл 2 М КОН,На дно пробирки выпадает осадок перхлората калия. По 0,1 мл надосадка фффффиз каждой пробирки переносят в пробирку для определения концентрациикреатина, В пробирку с образцом добавляют 1 мл 17-ного спиртового раствора нингидрина, тщательно перемесодержание общего креатина в ткани, мкмоль/г;содержание свободногокреатина в ткани,мкмоль/г;содержание креатинфосфатав ткани, в мкмоль/г;интенсивность флюоресценции образца после гид.ролиза;интенсивность флюоресценции образца без гидролиза;интенсивность флюоресценции контрольного образца;интенсивность Флюореспенции стандартного образца; 40коэффициент разведения,равный 18,75;концентрация стандартакреатина, равная2,5 ммоль/л. где Кфкцб К св КФА к ст 45П р и м е р 1. Навеску 100 мг 1 кани икроножной мьппцы задней конечности крысы поместили в жидкий азот, растерли в фарФоровой ступке и залили 2,5 мл 0,5 М НС 10. Гомогенизировали в стеклянном гомогениэаторе Потера 1 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4 сС. В две пробирки (А и Б) отобрзли по О,2 мн надосадочной жидкости. В пробирку А сразу добавили 0,1 мл 2 М КОН. Пробирку Б поместили на 2 мин в кипящую водяную баню при 100 С,затем в воду со льдом и добавили 0,1 мл Э 1497576 ш(вают 1 через 1 мин добавляют 2 мл 107.-ного КОН, через 4 мин после добавления 107.-ного КОН измеряют интенсивность флюоресценции при Мь495 нм при длине волны возбуждающего света Л вьзв. = 390 нм. ОдновремЕнно контрольный и с(гандартный образцы обрабатывают аналогичным обраэрм нингидриновым реактивом и ще- О лЬчью. Контроль 0,5 мл воды, станд рт 0,45 мл воды и 0,05 мл раствор креатина 2,5 мМоль. Расчет содерж ния в ткани метоболитов осуществляе ся по формулам: 5А-кК =- --- -хРхСсв ст - к1 2 М КОН, Из пробирок А и Б перенесли по 0,1 мл жидкости в пробирки А и Б 1 и добавили по 0,4 мл воды. В пробирку К (контроль) поместили 0,5 мл воды, а в пробирку ст (стандарт) - О,45 мл воды + 0,05 мл стандартного раствора креатина, содержащего 2,5 мМоль/л. В пробирки А и Б , ст, к добавили по 1 мл спиртового раствора нингидрина, через 1 мин туда же добавили по 2 мл ОЕ-ного КОН и ровно через 4 мин после добавления 1 ОЕ-ного КОН измерили интенсивность Флюоресценции проб на Флюориметре "БИАН" при Я вовк = = 365 нм, Я , = 510 нм. Получили следующие значения интенсивности флюоресценции в относительных единицах; 1 = 291= 52 Т = 2ф Д 1 ь 1 - ( 1 Хот = 51.Содержание свободного креатина в ткани рассчитывали по формуле:. ст- - кПолучили значение 25,81 мкМ/г. Содержание креатинфосфата рассчитывали по формуле:ьт ( т , х 18,75 х 2,5.- ст - КПолучили значение 2210 мкМ/г.П р и м е р 2, Способ использовали для определения содержания креатинфосфата и креатина в икроножной мышце крыс в норме и при 30-минутной ишемии задних конечностей. Ишемию вызывали наложением резинового жгута на верхнюю треть бедра. Определение содержания креатинфосфата и креатина осуществляли аналогично примеру 1. Результаты представлены в таблице.Характеристика способа.Способ позволяет определять содержание креатинфосфата в тканях до 0,5 мкМ/г, креатина до 0,2 мкМ/г.Определяли содержание креатинфосФата и креатина в 10 параллельных образцах. Для креатинфосфата М8,9; С,( = 10,1; о = 0,9; для креатина М = 18,1; 6 = 0,6; С= 3,1.формула изобретенияСпособ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани, включающий экстракцию497576 бфосфата осуществляют водным раствором НС 10 в течение двух минут нриф100 С, а определение креатина проводят на флюориметре при длине волнывозбуждения 360-420 нм и флюоресцендни 480-510 нм 5 1 кислотой, гидролиз креатинфосфата до креатина и регистрацию содержания креатина до и после гидролиза, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, гидролиз креатинОпределение содержания креатинфосфата и креатина предложенным способом в нормальной и ишемизированной икроножноймышце крысы Содержание креатинамкМ/г Груп- Ифпа и/п Содержание ИнтенсивИнтенсивностьфлюорескреатинфосфата,мкМ/г ностьфлюоресценциипробыпосле ценциидо гидролиза гидролиза 24,5 25,5 25,5 25,5 25,0 27,0 26,5 26,5 17,0 17,5 18,0 17,0 18,0 17,0 17,0 16,5 1 2 3 4 5 6 7 8 Норма 27,5 25,5 25 ф 5 23,5 25,5 25,5 25,0 23,5 29,5 28,5 28,0 25,5 26,5 . 28,5.28,5 27, 5. Ише мия 2 30 ми нут 4 5 6 7 8М+ш П р и м е ч а н и е, Контроль 1; стандарт 43,Составитель В.МитюшинРедактор Л.Пчолинская ТехредЛ.Олийнык Корректор Л,Бескид ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5