Способ получения кислой фосфатазы

быть использдвано для получения кис=лых фосфатаз, Цель изобретения - повышение активности и выхода ферментаИзобретение заключается в том, чтов качестве продуцента кислой фосфатазы используют полиплоидный штаммдрожжей с псевдомицелиальным типомроста Басс 11 агошусея сегегзае ВКТР 1У. Активность секретируемой фосфатазы после 16 ч культивированияна среде, содержащей (г/л) глюкозы20, пептона 20, КНРО 4 0,03, составляет 124,0 + 12,0 Ед, фосфатазы, сорбированной на поверхности клеток,700.35, 0 Ед. 1 ил 3 табл. нныихноломожет но сказаться на площади клеточной поверхности. Кроме того, изменение морфологии клеток затрагивает структуру клеточной оболочки, что также может влиять на секрецию экзоферментов, Совокупность перечисленных характеристик создает реальные предпосылки для получения КФ из полиплоидных штаммов дрожжей-сахаромицетов с псевдомицелиальным тиром роста.П р и м е р 1Получение тетраплоида с псевдомицели м л ч альным типо с щного штамтипом роста Для получения полипл ма с псевдомицелиальным (Ерш) проводят серию скНа чертеже представл реализующая способ.Гаплоидные штаммы, и для получения тетраплои ют следующий генотип: ещивания.на схема,пользованныеа 4-295, имеГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Ленинградский государствеуниверситет и Ленинградский тегический институт им. Ленсовета(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ 57) Изобретение относится к иологической промышленности Изобретение относится к микробиоогической промышленности, точнее к тем ее отраслям, где микробиологическим объектом технологического про-:. цесса являются дрожжи-сахаромицеты, и может быть использовано для полу- ения кислых фосфатаз.Цель изобретения - повьппение активности и выхода кислой фосфатазы.Способ заключается в том, что в качестве продуцента кислой фосфатазьг, используют полиплоидный штамм с псевдомицелиальным типом роста БассЬагошусез сегеч 1 згае ВКПМ У.Кислые фосфатазы (КФ) относятся к экзоферментам. Количество секретируемой КФ пропорционально площади по- верхности клетки. Полиплоидные штаммы дрожжей с псевдомицелиальным типом оста имеют крупные клетки с измененной морфологией, что может существен 1495376 А3 1495372 Ь-П 5003-МАТ Ы.1 еи 2-2 ига 3 грщ 3 грщ 64 А-П 5152-МАТ Ы.гМ 4-В 15 грщ 32 Г-П 5078-МАТ оСаде 1-6 грщ 3.Все культуры депонированы во Все 5союзной коллекции промьппленных микроорганизмов ВНИИ генетика, где имприсвоены следующие номера: 2 Б-П 5003У, 4 А-П 5152 - У, 2 Г-П 5078 -У4-295 - У. 1 ОПри выделении полиплоида с псевдомицелиальным типом роста используют метод, основанный на гомоэиготизации по локусу типа спаривания.,Генетические данные, подтверждающие плоидность штамма ВКПМпредставлены в табл.1,В связи с тем, что выделенный тет"раплоид Нрщ не спорулирует, гомозиго.ту по полу ВКПМ Ускрещивают с 20автодиплоидом 3-П 219 генотипа МАТа//МАТа айе 1/айе 1 Йхв 7/Ьв 7 1 ув 2/1 ув 2,Анализируют полученный гексаплоид6-5, Фертильность аскоспор 6-5 непревышает 507, поэтому анализируют 25случайную выборку аскоспор. Полученные расщепления по ауксотрофным маркерам соответствуют теоретически ожидаемым при предполагаемом уровнеплоидности ЗОП р и м е р 2. Оценка активностисекретируемой кислой фосфатаэы (Кф)у штамма ВКПМ У.Для характеристики секретной ак- .тивности по Кф дрожжи выращивают всреде, содержащей в 1 л дистиллиро-.ванной НО 20 г глюкозы; 20 г пептонаи 30 мг КНРО 4. Выращивание проводятв течение 20-24 ч в колбах Эрленмейера (объем среды - 100 мл), на качалке .40(235 об/мин). Определение биомассыдрожжей проводят нефелометрическимметодом на ФЭК-М.Для количественного определенияактивности Кф, экскретируемой дрожжами в,культуральную жидкость, используют калориметрический метод, основанный на способности Кф отщеплятьот паранитрофенилфосфата (п-НФФ) фос фор, в результате чего образуетсяпаранитрофенол (п-НФ), имеющий максимум поглощения в области 410 нм. Ферментативную активность выражают вмкМ п-НФ, образующегося за,1 мин при33 С, принимая Е= 12500,Удельную активйость КФ выражают в.мкМ и-НФ/мин/мг белка клеток дрожжей,Расщепление гексаплоида 6-5 показано в табл.1. Активность Кф у штамма Упока-.зана в табл.2. В качестве контрольного используютштамм Бассйагощусев сегевае 0-6,Статистическая обработка данных покритерию Стьюдента свидетельствует,что после 4 ч выращивания не выявляются достоверные отличия по количеству экскретируемой КФ между контрольным штаммом и У18 (М 1 й = 3,87,= 4,30). Однако по мере роставыявляется достоверное превышениеактивности Кф штамма Унад контролем (ЫГ = 12,8; 4,8; 8,8; 8,9соответственно для измерений после812, 16 и 20 ч роста).П р и м е р 3. Сравнение активности Кф у штаммов различной плоидности и морфологии.Активность КФ оценивают после 16 чроста культуры.Результаты проведенных опытов суммированы в табл.З.Данные табл.З,указывают на возрастание активности КФ как секретируемой, так и сорбированной на поверхности клетки в соответствии с плоид-"ностью клетки, В то же время штаммы,образующие морщинистые колонии (МК).с псевдомицелиальными клетками, характеризуются более высоким уровнем секреции: активность секретируемой Кф у морщинистых штаммов превосходит вдвое таковую у гладких штаммов той же плоидности.Физиолого-биохимическое описаниештамма БассЬагощусев сегечгвае ВКПМУ,Штамм является тетраплоидом, получен в результате серии последовательных скрещиваний.На средах УАРД, полной с пептоном;ПЕПФО и минимальной, штамм образуетморщинистые колонии из псевдомицелиальных клеток. В жидких средах тогоже состава образует быстро осаждающиеся скопления клеток.Состав сред, УАРД; пептон 20 г,глюкоза 20 г, дрожжевой автолизат,10 мл, КНРО 0,9 г, МЕБ 01 0,5 г,1495376 Таблица 1 Сравнение стеоретическиожидаемым Поли- плоид Соотношение феноГенотип Расщепление по типов х Р 6-5 2 Щ 1 еп; ТНР гЬг 4; АВЕ 1 ас 1 е; 1 еп 2 НТ 87; 1з 72У 82 1 22ААЗЫ аДе 1 цга 3. 151 24 3,54 0,05 171 4 3,25 )0,05 Таблица 2 Время ферментации,ч Активность Кф У4 8 12 16 20 6,2+1,619,8 + 1,262,0 + 1,591,0 + 0,982,0 + 4,7 12,4 + 0,2 40,9 1 0,5 74,0 + 2,0 126,9 + 0,7 135,0 + 3,7 Активность Кф Плоидность Штамм Морфо логия Секретируемая Кф, сорбированнаяКФ на поверхностиклетки МК 2551 27 МК 40,0 4 4,5 ИК 124,0 + 12,0 230,0 + 24,0 380,0 + 29,0700,0 ф 35,0 У П Уи 2 п 4 пНа среде с ацетатом натрия переходит к спорообразованию . Аски ромбические.Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, галактоэу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, фруктозу, не усваивает сорбоэу, лактозу, мелибиозу, ,растворимый декстрин, арабинозу.Отношение к спиртам, Усваивает этанол, глицерин.Может использовать в качестве единственных источников .азота (ИН ) 804ИН ИО, ИаЮз, мочевину, гидролизат панцирьсодержащего сырья (гидролиэат криля - отходы рыбной промышленности), гидролизат белково- витаминного концентрата, дрожжевой экстракт, пептон.Оптимальная температура культивиОрования 30 С. Активность зависит от температуры куя: тивирования, уро;,ня аэрации и рН, Оптимальньпс режим при исходном значении рН 3,5-4,0 скорости растворения кислородаИЕ 02о16 - 76 - и температуре 30 С..ч/ч формула изобретения Способ получения кислой фосфатазы, предусматривающей выращиваниедрожжей рода Яасспагошусез на питательной среде, содержащей источники 15углерода. азота неорганический фосфат и воду, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что,с целью увеличения активности и выхода фермента, в качествепродуцента используют полнплоидныйштамм дрожжей а псевдомицелнальнымтипом роста Бассйагошусез сегеч 1 з 1 аеВКПМ У,1495376 Продолжение табл.З Активность Кф Штамм Илона ность ГК ГК Примеч ани МК - морщин с евдомицел тые колонии, содальные клетки; ГК гладые кле ержащие дрожж ие нии и ОпределяКф после то т от сре/7 Р У-ЮМ Составитель Е.ВоробьеваРедактор Н.Гунько Техред МЦидык Корректор О,ципле аказ 4216/25 Тираж 500 ПодписноеНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва Ж, Раушская наб., д. 4/5 зводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10 10 Г-Д 145П 4-293-24 1 Секретируемая Кф, сорбированнКФ на поверхностиклеткил12,5 + 1,5 230,0 + 24 0 21 0 + 3 5 320 О 4- 32 0 560 + 85 6600 + 400 т активность сорбированнойо, как клетки дважды отмыы.