Способ получения щелочной фосфатазы

(5)5 С 12 М 9/16 ЕТЕН САНИЕ У СВИДЕТЕЛЬСТ К АВТ ласти полфатазы жия находит м анализе, еивпроновых кисо упрощае сырья;жность из пе ючить трудозистой обуслой очисткой ществен обработкивозмо сырья иск ления сли эффективн тап пе вичнои ОО Я рвичнои обработки мкий процесс отдеовлена также более фермента на послеГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР"Биолар", Всесоюзный кардиологическийнаучный центр АМН СССР и Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов) ахбопзЫ М.О. В 1 о 1, Спегп, 1975, чо.250,15,рр.6040-6045,Оачез М,У. МотгоМ У, Согпр. ВосйегпРйузо 1972, чо.42 В, рр.345 - 346. Изобретение относится к обучения очищенной щелочной фосвотного происхождения, котораприменение в иммуноферментнонаучно-исследовательской работизводстве нуклеозидов из нуклеилот,Целью изобретения является повышение активности фермента. упрощение технологического процесса и расширение сырьевой базы.Получение щелочной фосфатазы активностью 125-130 ед/мг белка достигается суммарным действием ряда факторов;использование в качестве сырья отходов промысла морского зверятонкий кишечник тюленя позволяет расширить сырьевую базу получения щелочных фосфатаэ животного происхождения и за счет высокого содержания фермента и в ткани получить гомогенизат со сравнительно вы.5 О. 1287593 А 1(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧ НОИ ФОСФАТАЗЫ, включающий гомогенизацию исходного сырья животного происхождения, экстракцию н-бутанолом, разделение фаэ и хроматографическое разделение, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности фермента, упрощения технологического процесса и расширения сырьевой базы, в качестве исходноо сырья используют отходы промысла морского зверя - тонкий кишечник тюленя, экстракцию ведут при 35 - 40 С, водную фазу диализируют с последующим осаждением этанолом из диализата ферментного препарата при конечной концентрации 55-65 об.о причем хооматографическое разделение осуществляют на ДЭАЭ-сфероне. сокой исходной активностью без предв тельной стадии отделения слизистой, чт х стадиях,ышение температуры до 35- 40" С ствует более эффективному проведетракции липидных примесей и-бутас одновременной очисткой от абильных белков, которые денатурии выпадают в осадок,ждение этанолом проводится при льной для осаждения щелоч,ой фостюленя конечной концентрации эта- -65%, что способствует Увеличению по активности, 1(рол 1 е того, на дандии происходит концентрирование пов способ нию зкс нолом термол руются оса оптима фатазы нола 55 выхода ной стаФермента и отпадает необходимость концентрирования образца, наносимого на колонку, иа последующей стадии хроматографии;применение в качестве хроматографической стадии ионообменнай хроматографии на ДЭАЭ-сфероне, нв которой кроме очистки фермента происходит и ега концентрирование с лимитирующим фактором для хорошего разделения, также исключает , необходимость в стадии концентрирования ультрафильтрацией, Кроме того, эта позволяет существенно соратить по сравнению с процессами на Сефадексах 6-75 и 8-200 продалкительность хроматаграфического цикла за счет увеличения скорости элюирования, что делает возможным проведение процесса при комнатной температуре без инактивации фермента.Предлагаемый способ заключается в следующем: 0,5 кг свежезамороженнога тонкого кишечника тюленя размельчают, загружают в гомагенизатор и добавляют 0,5 л буферного раствора 0,05 М трис-НО, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ М 9304 ТМ буФер), проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы. Обьем полученного гамогенизата - около 2 л.К гомагенизату добавляот 2 л н-бутанола и проводят экстракцию при 35 - 40 С в течение 1,5 ч,После зкстракции и разделения Фаз бутанальную Фазу отбрасывают, а водную фазу 1,0 - 1,3 л) диализируют против 10 л ТМ буфера в течение 24 ч при 4-5 С. Буфер заменя,ат свежим через 12 ч,Получают 1,5-2,0 л диализата,К полученному диализату при медленном перемешивании добавляют предварительно охлажденного до 4"С этанола до конечной концентрации 55-55 об.0/ выдерживают в течение ЗО мин при 4 С и осадок отделяют центрифугированием, Полученный осадок растворяют в 250 мл буФера 0,05 М трис НС, 0,01 М МдС 1,рН 8(буфераА);и фильтруют для удаления нерасттворившихся частиц. Фильтрат наносят на колонку 5 х 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и предварительно уравновешеннуо буферам А, Н а н есение образца и элюираваиие осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ(ЧССР) со скоростью потока 1,2 л/ч, Элюирование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в буфере А концентрацией КаС 1 ат О до 1 М.В процессе хроматаграфирования отбирают фракции по 20 мл. В полученных фракциях определяют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность фермента и выход по активности, 5 10 20 После храматографической очистки наДЭАЭ-сфероне активность щелочной фасфатазы составляет 120-130 ед/мг белка ивыход до активности 80-84%,За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего отщепление 1 мкМ неорганического фосфата при рН 9,3, 37 С в присутствии 10 мМ МЯСА,Верхняя граница температуаы экстракций н-,бутанолом 40 С обусловлена тем, что при более высоких темпераурах происходит термоинактивация щелочной фосфатазы,Нижняя граница температуры эктракции н-бутанолом 35 С обусловлена снижением при более низких температурах вь 1 хода по активности из-за неполной экстракции фермента из ткани за дачиь 1 й промежуток времени,Верхняя граница конечной концентрации этанола г и осаждении 80 об,% обусловлена тем, чта при аалее высокойконцентрации этанола вся фосфатаза уже осаждена и происходит осаждение балластных белков, что приводит к уменьшениюстепени очистки на даииай стадии и в конечном итоге к уменьшению активности целевого продукта,Нижняя граница конечной концентрации этанола при осакдении 55 об.% Обус 30 ловлена тем, что при более низкойконцентрации этанола большая часть щелочной фасфатазы остается в растворе, чтоприводит к уменьшению выхода процессапо активности.35 П р и м е р 1. 0,5 кг свежезаморожен ноготонкого кишечника тюленя размельчают, загружают в гомагенизатор и добавляют 0,5 лТМ буфера и проводят гомогенизациа дополучения гомогенной массы. Получают40 1,9 л гомогеиизата,К гамогеиизату добавляют 1,9 л н-бутанола и проводят экстракцию при 35 С в течение 1,5 ч,После экстракции и разделения фаз бу 45 танольную Фазу атбрасываот, а водную фазу 1,1 л) диализируют против 10 л ТМбуфера в течение 24 ч при 4 С, Буферныйраствор заменяют свежим через 12 ч, Получают 1,6 л диализата.50 К полученному диализату при медленном перемешивании добавляют предварительно охлажденного до 4 С этанола доконечной его концентрации 55 аб.%, выдерживают в течение ЗО мин при 4 С и осадокотделяют центрифугированием, Полученный осадок растворяют в 250 мл буфера А ифильтруют для удаления нерастворившихсячастиц,Фильтрат наносят иа колонку размеров5 х 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и1287593 Составитель Техред М,Моргентал КоРРектоР Е,Г 1 апп Редактор Л.Письман Заказ 544 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035,Москва,Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 предварительно уравновешенную буферомА, Нанесение раствора щелочной фосфата-,зы и элюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ(ЧССР) со скоростью протока 1,2 л/ч, Элюирование проводят в градиентном режиме сувеличивающейся в элюирующем буфере Аконцентрацией йаС от 9 до 1 М, В процессехроматографирования отбирают фракциипо 20 мл, В полученных фракциях определяют активность щелочной Фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельнуюактивность фермента и выход по активности,После хроматографической очистки на 15ДЭАЭ-сфеооне активности щелочной фосфатазы составляет 125 ед/мг белка, выходпо активности 80,5. П р и м е р 2, 0,5 кг свежезамороженного 20 тонкого кишечника тюленя размельчэют, загружают в гомогенизатор, добавляют 0,5 л ТМ буфера и проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы, Получают 2 л гомогенизата. 25К гомогенизату добавляют 2 л н-бутанолэ и проводят экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч, После экстракции и разделения фаз бутанольную фазу отбрасывают, а водную фазу(1,2 л) диализируют против 10 л ТМ 30 буфера в течение 24 ч при 4"С. Буферный раствор заменяют свежим через 12 ч, По лучают 1,6 л диализата.К полученному диэлизату при медленном перемешивании добэвльчот предварительно охлажденного до 4 С этэнолз до конечной его концентрации бО об,;6, выдерживают в течение 30 мин при 4 С и осадок отделяют центрифугированием. Полученный осадок растворяют в 250 мл буфера А и фильтруют для удаления нерастворившихся частиц.Фильтрат наносят на колонку размером 5 х 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и предварительно уравновеше ную буфером А, Нанесение раствора щелочной фосфатэзы и элюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ (ЧССР) со скоростью протока 1,2 л/ч, Элюирование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в элюирующем буфере А концентрацией КаС от Ода 1 М, В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл, В полученных фракциях определяют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность Фермента и выход по активности.После хроматогрэфической очистки на ДЭАЭ-сфероне активность щелочной фосфэтазы составляет 130 ед/мг белка выход по активности 84%.