Способ определения активности щелочной фосфатазы

Изобретение относится к способам определения ферментов, а именно щелоной фосфатаэы, и может быть примекео в иммуноферментном анализе различных биологически активных соединений в клинической диагностике, в, микробиологических отраслях промышленности, аналитиеской химии и др.Цель изобретения - увеличение чувствительности, упрощение и ускоре. н определения активности щелочкой ф сфатаэы,Способ осуществляют следующим об. р зом. 15В кювету спектрофотометра вносят 09 мп 0,05 М трисС 1 буфера рН 8.,5- 9,1, содержащего 10 М М 8 С 1, 100 мкл о ределяемого образца, НАДФН с кон чной концентрацией 10 - 10 М и-т Ф и кубируют 10-15 мин при 30-37 С. Посл этого в кювету добавляют 1 мп рас вора, содержащего в конечных конц нтрациях, М: АДГ из печени лошади 5 10 -10 , и-китроэо, -диметил-т к а н (НДМА) 510 -3 10 , этанол 0,1- 1 амид салициловой кислоты (АСК) 12 10 -5 10 , ортофосфат натрия 0,05 в том же буфере, и определяют скоррсть Ферментативной реакции по 30 увеличению оптической плотности и и 687 нм эа 1-3 мин. Контроль эа ф новой реакцией в системе регенераи осуществляют аналогично укаэанном, но из системы исключается опредляемый образец,Фоновая реакция протекает вследствие содержащегося примесного НАДН в субстрате НАДФН, а также неферментативного гидролиэа НАДФН за время нкубаиди,Эффект усиления в данной системе регенерации кофактора достигается За счет циклического процесса окисления - восстановления НАД(Н) в акивном центре фермента с параллельным г 1 ротеканием необратимых реакций окисЛеиия спирта и восстановления НДМА. Раствор НДМА имеет желтую окраску (В= 440 нм), а при ферментативлом восстановлении он обесцвечивается Для удобства слежения за скоростью реакции по возрастанию оптической плотности раствора от нулевого уровйя в реакционную среду вводят АСК, который, взаимодействуя с продуктом Восстановления НДМА, образует голубой краситель ицдалин, имеющий максимум поглощения в вилкмой области спектра при 687 км.По калибровочному графику зависимости скорости реакции от концектрации щелочной Фосфатаэы в растворе можно с высокой чувствительностью определять содержание фермента в образце.Предлагаемая система регенерации кофактора проще по сравнению с известной, так как. включает всего один Фермент и позволяет определять НАД(Н) в минимальных концентрациях за меньший отрезок времени, Выбор АДГ печени лощади в качестве фермента регенерации обусловлен ее способностью осуществлять циклический процесс окисления - восстановления кофактора при участии двух сопряженных субстратов, в отличие от дрожжевой АДГ, используемой в известном способе, которая участвует только в восстановлении НАД и НАДН, при этом для регенерации НАД из НАДН требуется введение в систему второго фермента-диафоразы,Выбор диапазона концентрации АЦГ обусловлен пропорциональным увеличением скорости реакции при возрастании концентрации АДГ в растворе. При со держании АДГ выше 10 М в системе наблюдается усиление фока реакции от примесного эндогенного НАД, содержащегося в препарата фермента, а также возникают трудности детектирования вследствие высоких скоростей реакции.Диапазоны концентраций сопряженных субстратов - НДМА и этанола выбраны с учетом насыщения фермента по субстрату (К ) и постоянства скорости ферментативной реакции.Использование субстратов в концентрациях ниже указанных пределов приводит к пропорциональному снижению скоростей, а вьппе " к непроизводительному расходу реагентов. АСК вводится в систему в большом избытке для достижения максимальной скорости взаимодействия с продуктом восстановления НДМА, Верхняя граница мМ обусловлена независимостью наблюдаемой скорости реакции при дальнейшем повьппении концентрации АСК в реакционной среде.В качестве буферной среды в системе регенерации предлагается трис-НС 1 с тем же рН, что и на стадии инкубации щелочной Фосфатазы с субстратомНАДФН. Наблюдаемая скорость ферментативной реакции в системе регенерациирезко возрастает с увеличением рН,среды в интервале ,2-9, 1. Дальнейшее увеличение рН на изменение скорос.ти практически не влияет.Дпя сближения рН оптимумов действия щелочнойфосфатазы и АДГ в данной системе выб"ран рН в интервале 8,5-9,1, верхняя 10граница которого лимитируется буферными свойствами трис-,НС 1. Использование трис-НС 1 в качестве буфера всистеме регенерации обусловлено тем,что он является хорошей ловушкой ингибитора фермента - ацетальдегида,образующегося при окислении спирта.Молекула триса (3-оксиметиламинометан) содержит в своем составе свободную аминогруппу, способную эффективно связывать альдегид (с образованиемшиффова основания),Дпя инактивации щелочной фосфатазы с целью проведения реакции во вторичной одноферментной системе регенерации с постоянной скоростью (ед.опт. пл/мин) в систему вводят ингибитор щелочной фосфатазы - ортофосфатнатрия в конечной концентрации 0,05 М,Использование восстановленной формы НАДФН связано с его повышеннойпо сравнению с НАДФ стабильностью вщелочной среде, Содержание НАДФН врастворе варьирует в пределах 10-Ф10 М. Верхняя граница обусловленанезависимостью ферментативной скорости реакции от концентрации НАДФН,а также возможным возрастанием фоновой скорости реакции, нижняя - уменьшением ферментативной скорости и 40как следствие снижением чувствительности определения щелочной фосфатазы.На фиг, 1-4 приведены зависимости наблюдаемой скорости (ед.опт.пл . х 10 мин ) ферментативного восстановления НДМА в системе регенерации кофактора от концентрации С(М), щелочной фосфатазы в растворе в логарифмических координатах при различных рН буферной среды 1 фиг. 1 - рН 509, 1 (а), 8,5 (Ь), 8,0 (с)3, при раз-личных концентрациях в системе НАДФН1 фиг. 2-10 М(а); 410 М (Ь); 5 ф10 М (с)Д, АДГ 1 фиг. 3 - 10М (а);2 510 М (Ъ)5 10 (с)55П р и м е р 1. Определение активности щелочной фосфатазы в растворе-н ив области концентраций 10 -10 М с использованием одноферментной системы регенерации кофактора.Приготовляют растворы 0,05 трисНС 1 буфера рН 9, 1, содержащего: МяС 110 М, НАДФН в концентрации 5 10М; Ма РО 1 М; АДГ 1 ОМ в этом же буфере; этанольные растворы НДМА 4- 4,5 мг/мп; АСК 20 мг/мл; стандартные растворы щелочной фосфатазы с удельной активностью 1000 Б/мин мг белка в области концентраций 10 -10 М в-15 -и воде или трис-НС 1 буфере рН 8,0.В отдельной емкости готовят субстратную смесь, содержащую, мл: буфер 8,5, раствор НДМА О, 1, раствор АСК 0,2, раствор ИаР 041, раствор АДГ 0,2, общий объем которой составляет 10 мп (на 10 анализов). В кювету спектрофотометра вносят 0,7 мл трис-НС 1 буфера, 100 мкл стандартно-, го раствора щелочной фосфатазы и 200 мкл раствора НЛДФН. Смесь инкубируют в кювете при 30 С 15 мнн, Пос" ле этого в кювету добавляют 1 мл субстратной смеси и определяют возрастание оптической плотности за определенный промежуток времени (1 мин) при%, = 687 нм, что соответствует скорости ферментативной реакции (Ч;ед,опт.пл./мин) .Полученная зависимость наблюдаемой скорости ферментативного восста" новления НДМА в системе регенерации кофактора от концентрации щелочной фосфатазы в инкубируемом растворе в логарифмических координатах приведена на фиг. 1 аВидно, что с увеличением концентрации щелочной фосфата" зы в области 10 -10 ЭМ, скорость ре-сб цакции в системе пропорционально возрастает. Вследствие того, что очень высокие скорости реакции в системе в области больших концентраций щелочной фосфатазы технически трудно измерить, определение активности проводят при уменьшении концентраций реагентов в системе (НАДФН, АДГ, НДЫ и пр.) или при снижении рН реакционной смеси, что уменьшает ферментативную скорость реакции.П р и м е р 2. Определение активности щелочной фосфатазы в растворе в области концентраций 10 -10 М с-к )г использованием одноферментной системы регенерации кофактора.А. Приготовляют раствор 0,05 М трис-НС 1 буфера рН 8,0, Растворы реагентов готовятся из тех же веществ ив тех же концентрациях что н в пример 6 1, но рН используемого трис-НС 1 буфера равен 8,0, а конечная концент- рация НДИА в реакционной смеси состав ляет 5 10 М. Определение активности-б щелочной осфатазы проводят аналогично примеру 1. По полученным значениям строят калибровочную кривую зависим сти скоростей ферментативной реаки в системе от концентрации щелочи й Фосфатазы в логарифмических коорнатах (фиг. 1, кривая с),Б. Все растворы реагентов и субс 1 ратная смесь готовятся аналогично 15 и имеру 1 с использованием 0,05 М т ис-НС 1 рН 9,1. В кювету спектрофот метра вносят 0,9 мл буера, 0,1 мл с андартного образца и 10 мкл исход 1 го раствора НАДФН с конечной кон центрацией в кювете 5 10 М. Дальнейшее проведение анализа выполняется а алогично примеру 1, при этом конеч-.я концентрация АСК в системе составляет 2 10 М, Калибровочная кривая (с) приведена на фиг, 2,В. Буферный раствор и растворы реагентов приготовляются аналогично цримеру 1. Субстратная смесь готовится так же, как в примере 1, но берут ЗО 10 мкл исходного раствора АДГ с к;неч йой концентрацией в системе бф 10 М и соответственно 8,7 мл буфера. Анаиз проводится согласно методике при" ера 1, Калибровочный график (с) заисимости скорости Ферментативной пеакции в системе от концентрации иелочной Фосфатазы приведен на фиг.3.Таким образом, ферментативная скорость реакции в системе регенерации 40 Жофактора линейно возрастает с увеЛичением концентрации щелочной ФосФатазы. При отклонении от оптимальНых условий определения щелочной Фос" фатазы в растворе (пример А-В) диапа зон измеряемых ее концентраций смещается в сторону больших величин почти на порядок.П р и м е р 3. Определение активности щелочной фосфатазы в исследуе- Щ иом образце с использованием однофер" ментной системы регенерации кофактораПриготовляют растворы буфера, реагентов и субстратной смеси аналогич" но примеру 1. Определение активнос В ти щелочной Фосфатазы в образце проводят аналогично примеру 1, отбирая по 100 мкл образца для каждого измерения вместо стандартного раствора фермента, Полученные значения скорости реакции переносят на калибровочную кривую (фиг. 1, кривая а). Для более точного нахождения неизвестной концентрации щелочной фосфатазы в исследуемом образце строят калибровочный график зависимости скорости реакции от концентрации щелочной Фосфатазы в растворе в нормальных координатах (Ч,ед,опт,пл./мин; С,М), выбирая при этом соответствующий более узкий:диапазон концентраций щелочной Фосфатаэы 10 -10 М в растворе (фиг. 4) .Полученные значения концентраций фермента в определяемом образце по калибровочной кривой приведены в таблице, Коэффициент вариации значений составляет 7,5%Коэффициент вариации КХ100% 7,5%.Предлагаемый способ определения активности щелочной Фосфатаэы отличается более высокой чувствительностью(доО М), экономичностью (вместо двух ферментов в системе определения используется один - АДГ), а его проведение требует незначительных затрат времени (15-20 мин, в известном способе до 3 ч).Предлагаемый способ может найти широкое применение в твердоазном иммуноферментном анализе антигенов и антител при использовании щелочной фосфатазы в качестве метки,Ф о р м у л а и э о б рСпособ определения активности щелочной фосфатазы, предусматривающий инкубацию определяемого образца с субстратом никотинамидадениндинуклео" тидосфатом (НАДФ) в буферной среде с последующей спектрофотометрической регистрацией продукта гидролиза в фер ментативной системе регенерации кофак тора, включающей алкогольдегидрогенаэу (АДГ) и два субстрата, одним иэ которых является этанол, о т л ич а ю щи й с я тем, что, с целью увеличения чувствительности, упрощения и ускорения споосба определения, инкубацию определяемого образца и ре. гистрацию продукта гидролиэа, катализируемого щелочной фосфатазой, осу" ществляют в трис"НС 1 буфере рН 8,5-9, 11449588 нитрозо-М,И -диметиламин в концентрации 51 О -3 1 О М, при этом вбсистему вводят амид салициловой кисе 5лоты в концентрации 210 -51 О Ми ортофосфат натрия до достиженияконцентрации 0,05 М. НАДФ используют в восстановленнойформе в концентрации 10 - 10 М, ав системе регенерации кофактора используют АДГ из печени лощади в концентрации 5 10 -1 О М, а в качестве второго субстрата используют п"пределенные Среднее эназначения,Х, чение, Х10 М 1 О 2,6 1,90 0,04 0,19 2,05 2,8 2,54 2,45 1,79 2,55 1,86 2,3 1,75 Экспериментальная ско рость Ч,ед опт.пл./мин специя, Выборочное10 стандратноеотклонениеБ х 10и ГКНТ СССР рафическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная Производственно Заказ 6934/28 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытия113035, Москва) Ж, Раушская наб., д. 4/5