Способ определения активности лизирующих ферментов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗ 06 РЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 12 3/О ОЬРЕТЕНИ ОПИС Н СВИДЕТЕЛЬС Н АВТОИЯ не,н учно-исследователь- ладной энэимологииОоЬхйаоГ СЬе йеФегвпе;1972, Р 36, р. 669 осфьполипазной акотенциометрического стоянном значении. е дело", 1978, Р 4 . ПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВЕРМЕНТОВ, пРеДУс.- титранта в реак(21 ) 3334679/28-13(71) Всесоюзный наский институт прик(54) (57) СПОСОБ ОНОСТИ ЛИЗИРУОЦИХ Фматриваюший подачу.ционную смесь, содержащую субстрати раствор лизнрующего Фермента, дляподдержания заданного значения рНн измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности, предварительноперед получением реакционной смесираздельно нейтрализуют раствор лизирующего Фермента и субстрат до заданого значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи поледнего .в субстрат, вводят растворлизирующего фермента в субстрат дляполучения реакционной смеси при достижении скорости подачи титрантав субстрат постоянного значения,а определение активности лизирувших Ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта вреакционную смесь и в субстрат.Изобретение относится к микробиологической промыыпенности, а именнок способам определения активностиферментов, обладающих способностьюлиэировать клеточные стенки микроорганизмов,Известен турэодиметрический способ определения активности лизирующих ферментов путем определенияоптической плотности суспензия испытуемого субстрата до и после воздействия ферментов (1 .Недостатком данного способа является значительная длительность определения активности лизирующих ферментов.Известен также способ определения активности лизирующих ферментов, предусматривающий подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизирующегофермента, для поддержания заданногозначения рН и измерение скоростиподачи титранта в реакционнуюсмесь 2) .Однако известный способ не обеспечивает получения точного результата, так как не учитывает влиянияавтолиза субстрата. Кроме того,измерение активности проводитсяв атмосфере азота, что усложняетпроцесс измерения и практическиспособ трудно применим для экспрессанализов,Цель изобретения - повышение точности определения активности лизирующих ферментов,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения активности лизирующих ферментов,предусматривающему подачу титрантав реакционную смесь, содержащуюсубстрат и раствор лизирующего фермента, для поддержания заданногозначения рН и измерение скоростиподачи титранта в реакционную смесь,предварительно перед получением реакционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента исубстрат до заданного значения рНпутем подачи титранта и измеряютскорость подачи последнего в субстрат, вводят раствор лизирующегофермента в субстрат для полученияреакционной смеси при достижениискорости подачи титранта в субстратпостоянного значения, а определение.активности лизирующих Ферментовосуществляют по разности скоростейподачи титранта в реакционную смесьи в субстрат.) На фиг. 1 изображена принципиальная схема установки рН-стата; на Ф 2 в . кривая титрования, где по Фиг,иноси абсцисс отложено время в м утах, аа по оси ординат - показанияприбора в миллиметрах. Для автоматического измеренияактивности лизирующих Ферментов используют установку рН-стата с автоматическим регистрированием кривыхтитрования (фйг, 1).5 Установка рН-стата включает термостатированную ультратермостатом УТ кювету 1, смонтированную над магнитной мешалкой 2, в которую вставленыэлектроды 3, соединенные с универ 10 сальным ионометром типа ЭВ4, скоторого сигнал, полученный от электродов 3, подается на блок автоматического титрования типа БАТ5и далее на автоматическую бюреткудозатор типа Бб. Автоматическая.бюретка-дозатор 6 через блок дифференцирования 7 связана с самописцемтипа КСП8,П р и м е р 1. Определение лизирующей активности дрожжелитическогоферментного препарата ГЗх.В 100 мл дистиллированной водырастворяют 0,2 г дрожжелитическогоферментного препарата ГЗх. рН ферментного раствора доводят до значе 25 ния рН = 8,1 при помощи 0,1 й КОН,В качестве субстрата используютсуспензию дрожжей Сапд 1 да о с 11 1 ь,выращенных на сульфитных щелоках.4 г сухих дрожжей заливают 100 мп30 дистиллированной воды и 1 мл 0,4 ного раствора мертиолята дляпредотвращения роста посторонней микро-.флоры и термостатируют в суховоздушном термостате в течение 24 ч35 при 37 С. В термостатированную кювету (при 40 С ) объемом 14 мл наливают 8 мл ранее приготовленногосубстрата и выдерживают 3 мин до достижения заданной температуры.При тщательном перемешивании рНсубстрата доводят до 8,1 (1 й КОН )и измеряют скорость антолиза субстрата, Для этого включают самописец,автоматическую бюретку и блок дифференцирования, При помощи самописца45 записывают скорость подачи титранта 0,035 М КОН из бюретки в кювету 1.Достигнутая постоянная скоростьподачи титранта в процессе автолизасубстрата (при рН 8,1) изображена50 кривой титрования аб (фиг. 2).После этого в ту же кювету вводят 2 мл ферментного раствора и продолжают титрование, и записываютскорость подачи титранта, используе 55 мого для нейтрализации образовавшихся кислотных эквивалентрв в процессеферментной реакции.По истечении 10-15 мин титрованиядостигают постоянную скорость подачй60 титранта и процесс останавливают путем выключения бюретки, самописцаи блока дифференцирования. Ферментная реакция соответствует65 участку кривой титрования вг (Фиг. 2 ),= 0,228 ед/мл Чисноопреде.нвний ХДисперсия, 5 Способ Лизирующая активностьРд/Г 1ед/мп Коэффициент, вариации Ч=- 1005 а Культуральная жидкость 5. а 1 Ьиь176 Ферментный пре- парат Предлагаемый 1,3 10,732 252 6,763,3340,000049 1,3 200 10 10 0,661 1,2 Для подсчета активности ферментаопределяют титр используемой щелочи,выраженной в микрограмм-эквивалентах на 1 мм (Тмкг-экв ОН). В кюммвету наливают 10 мл 1 М КС 1, устанавливают рН 8,1 и при перемешиваниидобавляют 0,5 мл 0,01 й НС 1, что рав.няется 5 10 6 г-экв кислоты. Принедвижущейся бумаге самописца оттитровывают введенную кислоту до задан Оного значения рн (8,1), при этом регистрируют расстояние в миллиметрах,.пройденное пером самописца Т=0,152,Активность лизирующего ферментного препарата определяют по формулеТ( СЧ - с 9 Ю)К190 ед/г,Оф 152(6 1) 500 - 190 где Т - титр используемой щелочи;мм-- угол наклона кривой титроминвания при ферментативной:реакции;мин- угол наклона кривой титрования при самопроизвольномгидролизе субстрата;11 - объем внесенного в субстратферментного раствора, (глп);К - разведение.30За единицу активности принимаюттакое количество фермента, котороевыделяет 1.мкмоль титруемых щелочьюкислот в 1 мин.П р и м е р 2. Определение ли.- 35зирующей активности культуральнойжидкости 5 тгерогпу се а 1 Ьц ь 176,Ферментогл служит неразведенная:культуральная жидкость 5 егер о аусеза 1 Ьц 176. рН культуральной жидкости 40доводят до 8,5 при поглощи 0,1 й КОН.В качестве субстрата используют дрожки Сапд гда цц 1111 егво пд 11,Ход приготовления субстрата попримеру 1. В терглостатированную: кювету при 45 ОС объемом 14 мл нали-,вают 8 мл ранее приготовленного субстрата и выдерживают 3 мин до достижении. заданной температуры,При тщательном перемешивании рН, субстрата доводят до 8,5 (1 й КОН) и измеряют скорость автолиза субстрата. Температура и рН проведе- ния реакции подобраны оптимальными для действия данного фермента на 1 субстрат. Ход определения лизирующей активности по примеру 1. Скорость автолиза субстрата С.цц 1 111 егпго пд,1 1 с 9 Ы = 1 мм/мин Скорость Ферментной реакции сдлк, = 4 мм/мин. Лизирующая активность культуральной жидкости 5. а 1 Ьц 176, вычислена по формуле,.указанной в примере 1. При проверке достоверности определения проведены сравнительные испытания по определению лизирующей активности Ферментных препаратов и культуральной жидкости 5. а 1 Ьц ь 176, В таблице приведены результаты трех серий определения активности лиэирующих Ферментных препаратов на субстрат дрожжи СаМ 1 да цс 1 11 а и трех серий определений активности с использованием культуральиой жидкости 5, а 1 Ьцз 176 на субстрат дрожжи Сапд Йа ец 1111 его опд 11.Как видно из приведенных дайггых разброс результатов в параллельных определениях активности лизирующих ферментов соответствует среднему значению коэффициента вариации - 1,33 для предлагаемого метода и 1,93 для метода по прототипу (вьаае известного на 07).Годовой экономический эффект при внедрении предлагаемого изобретения 12000 руб. в год.1041569 Продолженйв таблйцю СПОСОб ферментный препарат 1,2 0,322 0,000014 0,2610,000011 1,3 10 3 ИзВестный 1,8 274 10 1,8 232 10 1,9 188 10 10 2,1 10 2,2 1,8 3 Культуральная ЖИДКОСТЬ 8. а 1 орв176 ЧИ СЛООПРЕделеНИЙ Лизирующая акТИВНОСТЬед/гед/мл 0,811 О, 451 0,311 Дисперсия.,Я й1041569 Составитель Н. АрцыбашеваКовтун Техред М, ГергельКорректор И.Ватрушкина к Подписета СССРрытийнаб., д, 4/5 иал ППП "Патент", г; Ужгород, ул. Проектная, 4 Заказ 7066/27ВНИИПИпо д113035, М Тираж 523сударственного коми ам изобретений и о ква, Ж-.35, Раушска ду Л4 ьв юф