Способ определения активности протеолитических ферментов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик щ 977490(23) Приоритет -51)М Клз С 12 М 9/52 Гооударствеииый комитет Опубликовано 30.11.82. Бюллетень44Дата опубликования описания 05.12.82по делам изооретеиий и открытий(72) Автор изобретения Л. И. Позднякова Научно-исследовательский институт механики и,физикипри Саратовском ордена Трудового Красного Знамейи"-государственном университете им. Н. Г. Чернышевского(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ1Изобретение относится к микробиологии, а более конкретно к способам исследования ферментов. Известны способы определения активности протеолитических ферментов, основанных на гидролизе субстрата с образованием продуктов ферментативной деятельности и последующим выявлением этих продуктов. Например, для определения ферментативной активности в диализный мешок помещают биологически активную жидкость и исследуемый продукт, содержащий буфер и химический субстрат. В результате реакции получается диализируемый продукт распада субстрата. Мешок погружают в раствор, при этом продукты ферментативной деятельности диффундируют через мешок в раствор, в котором определяют активность данного фермента 111,Известен способ качественного определения активности протеолитических ферменния активности протеалитических ферментов Сущность способа заключается в следующем: рентгеновская пленка фиксируется тиосульфатом натрия и после промывания 2тщательно высушивается, испытуемый раствор наносится на пленку, помещается во влажную камеру, инкубируется. Затем пленка промывается, высушивается и красится амидочерным 10 Б. После этого пленка промывается 1%-ной уксусной кислотой 12,Наиболее близким к предлагаемому потехнической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности протеологических ферментов, предусматривающий приготовление на чашках Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением.Процесс определения активности проводится в следующей последовательности: на застывший агар наливается раствор казеина, который оставляется на полтора часа для диффузии последнего в агар. Специальной полой трубкой в агаре делаются лунки, которые заполняются испытуемым ферментгюным раствором. Инкубация проводится в термостате во влажной камере в течение 18 - 20 ч. Для облегчения чтения результатов белок в агаре фиксируется трихлоруксусной кислотой. При этом фон становит 977490ся молочно-белым, а вокруг лунки образуется ореол просветления 3.Недостатком метода являются его трудоемкость, продолжительность, необходимость проведения подготовительных операций: диффузии субстрата в агар и изготовления лунок.Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса определения протеолитической активности.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности протеолитических ферментов, предусматривающему приготовление на чашках Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, раствор субстрата непосредственно вносят в расплавленный агар, размешивают, разливают в чашки Петри, на застывший агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9 в 11 ч.Технология способа состоит в следующем.Приготавливают раствор субстрата, вно. сят, его в расплавленный и остывший до 60 С агар, устанавливают рН исследуемой протеиназы (для кислой протеиназы 3,5, для нейтральной 7). Приготовленную смесь разливают в чашки Петри по 10 мл и оставляют диски фильтровальной бумаги диаметром 10 мм. На диски наносится исследуемый ферментный раствор по 0,1 мл. Для предохранения фермента от подсыхания на крышку чашки Петри накладывают фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, Чашки инкубируются в термостате при 37 С 9 - 11 ч. По истечении указанного времени диски фильтровальной бумаги удаляют с агара, а агаровые пластинки проявляют 10 О/о-ным раствором трихлоруксусной кислоты или 5 О/о-ным раствором соляной кислоты. При этом поверхность агара приобетает молочно-белый цвет, на месте удаленных дисков при наличии активного протеолиза обнаруживаются хорошо выраженные прозрачные зоны.Пример 1. Определяют активность нейтральной протеиназы, выделенной из Егж 1 п 1 а саготочога 1. стгц 11 з штамп Мо 603 на казеине. Для приготовления 100 мл субстрата с казеином в 80 мл дистиллированной воды растворяют 1 г агара Дифко, а 20 мл воды используют для приготовления раствора казеина. 1 г казеина фирмы Реанал заливают 4 мл воды и оставляют для набухания. Затем казеин ставят на водяную баню при 60 С, по каплям добавляют 2 М раствора едкого натра (6 капель), затем наибольшими порциями приливают ос Пример 4. Определяют активность трипсина на желатине. Для приготовления субстрата растворяют в 20 мл бидистиллированной воды на водяной бане при 60 С и смешивают с остывшим до 60 С агаром. Далее проводят операции по описываемому способу. Время анализа 10 - 11 ч. Отмечен активный протеолиз.Таким образом, реализация изобретения позволяет упростить и ускорить процесс определения активности протеолитических ферментов. 30 35 Формула изобретения 40 Способ определения активности протеолитических ферментов, предусматривающий приготовление на чашках Петри агаровых пласти нок с добавлением белкового суб страта, нанесении на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, раствор субстрата непосредственно вносят 50 в расплавленный агар, размешивают, разливают в чашки Петри, на застывший агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9 в 11 ч.55 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент США Мо 3243147,кл. С 12 Р опублик. 1968. тавшуюся воду и выдерживают в бане дополного растворения казеина. Готовый раствор казеина смешивают с остывшим до60 С агаром. Устанавливают рН = 7. Далеепроводят операции по описанной выше технологии. Время, затраченное на анализ,равняется 11 ч. Активность нейтральнойпротеиназы обнаруживается по хорошо выраженным зонам,Пример 2, Определяют активность кислойО протеиназы, выделенной из Его п 1 а саго(очога 1. с 1(ги 111 з штамм Юо 603, на альбумине. Для приготовления субстрата бычийальбумин растворяют в дистиллированнойводе при комнатной температуре и смешивают с остывшим до 60 С агаром (в раст 5воре должно содержаться 1 О/о альбуминаи 2/о агара Дифко). Устанавливают рНсреды = 3,5 и проводят операции по описанной выше методике. Об активности протеолитического фермента судят по хорошо20 выраженным прозрачным зонам на местеудаленных дисков фильтровальной бумагой.Пример 3. Определяют активность пепсина на гемоглобине. Субстрат с гемоглобиномприготавливают аналогично альбумину.Через 0 ч инкубации обнаруживают актив 25ныи протеолиз.977490 Составитель Е. Воробьева Редактор А. Фролова Техред И. Верес Корректор О. Билак Заказ 9 П 7/32 Тираж 505 Поднисное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4