Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

3 2Е - оптическая плотность станстдартной пробы (не содержащей гемолизата и гидроперекиси трет-бутила);Е - оптическая плотность нитРропруссида в пробе, несодержащей супернатанта.П р и м е р 1. Определение активности ГП проводят в пробе с конечным объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 21 мМ СБН, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 100 раз (по отношению к эритроцитарной массе)о Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации в пробе 8 мМ. Окисление СБН останавливают через 10 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок 1 мл 37-ной НРО, приготовленной на насыщенном МаС 1.К серии опытных проб ставят контрольную и стандартную пробы. Гидроперекись трет-бутила в стандартной пробе, а гемолизат в стандартной и контрольной пробах замещают соответствующим объемом дистиллированной воды.Пробы центрифугируют при 1 2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного Г 1 аС 1, добавляют 0,5 мя 80 мМ нитропруссида Г 1 а и 0,05 мл 1,8 М НаСОи, Экстинкцию измеряют спектрофото- или фотоколориметрически через 15 с после добавления Г 1 аСОз при 540 нм. Фоновое поглощение нитропруссида Г 1 а определяют в пробе, не содержащей надосадка, Активность рассчитывают по формуле (1). Средняя активность ГП у 14 здоровых доноров 144,6 +22,4 ммоль/мин/л эритромассы. 1 128200Изобретение относится к биохимиии может быть использовано в аналитической и клинической биохимии дляопределения активности глутатионпероксидазы (ГП),5Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа засчет использования оптимальных концентраций субстратов и остановки реакции осаждением белка при 0 + 1 С. 10Способ осуществляется следующимобразом.К 0,5-5 мл венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА,1 мг/мл), осаждают эритроциты, промывают осадок О, 15 М хлористым натрием, приготовленным на 0,005 М фосфатном буфере, рН 7,4, к эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина О, 1 мг/мл в соотношении 1:2, а 20,через 30 мин - 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,4, в соотношении к гемолизату 1:14, 1:4.К О, 15 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,4 содержащего 0,002-0,03 МЭДТА и 0,025-0,035 М восстановленныйглутатион (СБН), добавляют 0,05 млразведенного гемолизата, выдерживают3-5 мин при 37 С и начинают реакциюдобавлением 0,05 мл 0,02-0,04 М гидроперекиси трет-бутила. После инкубаодии при 37 С в течение 4-10 мин осаждают белок на ледяной бане добавлением 0,5 мл 37,-ной НРО, приготовленной на насьщенном растворе Г 1 ас 1 Про бу центрифугируют, 0,05-0,1 мл супернатанта переносят в 3,9-3,95 мл насыщенного 1 ЯаС 1, через 3-60 мин добавляют 0,5 мл 0,08 Г 1 нитропруссида натрияи 0,5 мл 1,8 М Г 1 аСОз и через 15 с 40измеряют оптическую плотность при540 нм.Активность ГП в 1 л эритроцитарной массы рассчитывают по формулеСБН 1 Е- Е,А = - ,д. х--- Х Г 1,Ест Е рСБН 1 - исходная концентрацияаглутатиона;1й - время от начала до остановки реакции;М - фактор разведения эритромассы;Е - оптическая плотность контрольной пробы (не содержащей гемолизат);Е - оптическая плотностьапопытной пробы; П р и м е р 2. Определение актив ности ГП проводят по примеру 1, однако среда инкубации содержит 14 мМ СБН и гемолизат с конечным разведением в 150 раз. Реакцию начинают до-. бавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 4 мМ, а останавливают через 5 мин. Осаждение и определение уровня остаточного глутатиона проводят по примеру 1, Активность рассчитывают по формуле (1). Активность ГП составляет 144,6 + 4 ммоль/мин/л.Пи м е р 3. Определение активности ГП проводят в пробе с ко нечным объемом 0,5 мл, содержащей1282003 4ность рассчитывают по формуле(1). Активность ГП составляет144,6 + 4 ммоль/мин/л. Формула изобретения Составитель Н.ГуляеваРедактор И.Николайчук Техред Л,Сердюкова Корректор А,Ильин Заказ 7258/41 Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений н открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5.Производственно-полиграфическое. предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 18 мМ СБН, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 120 раз. Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакциюодобавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 6 мМ в начальный момент реакции, Окисление СЯН останавливают через 6 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок 1 мл 37.-ной НРОз, приготовленной на насыщенном МаС 1. Контрольную и стандартную пробы ставят по примеру 1.Пробы центрифугируют при 1 2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного ИаС 1, добавляют 0,5 мл 80 мМ нитропруссида Иа, а затем 0,5 мл 1,8 М Ва СОз. Экстинкцию измеряют через 15 с спектрофото- или фотокалориметрически. Фоновое поглощение нитропруссида На определяют в пробе, ,не содержащей надосадка. АктивСпособ определения активностиглутатионпероксидазы в эритроцитах 10 путем их гемолиза, инкубации гемолизата в присутствии восстановленногоглутатиона и гидроперекиси трет-бутила с последующим спектрофотометрированием, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точностии чувствительности способа, используют глутатион в концентрации 1421 мМ, гидроперекись трет-бутилав концентрации 4 - 8 мМ, реак цию останавливают осаждением белка при температуре 0 ф 1 С, а к суперонатанту добавляют нитропруссид натрия в щелочной среде.