Способ выделения тироксинсвязывающего глобулина

СТВ 6 Бюл иоо нической химии ленко, О.В,СвириА.Стрельченок(08 18. ОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТИРОГЛОБУЛИНА из сывор ИН- .,тки ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИД%крови путем хроматографии, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода белка, хроматографйю осуществляют на сорбенте,представляющем собой матрицу, ковалентно связанную с тироксином, с последующей промывкой сорбента бикарбонатным буфером,затем раствором холата натрия, элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере,1128569 5 1 О 15 25 30 35 45 Дальнейшую очистку полученного аффинного алюата от альбумина осуществляют на конканавалин-А-сефарозе в 0,05 М трис-НС, буфере (рН 7,4). 4 ТСГ элюируется 0,03 М раствором 4:-метил-Р-маннозида в 0,05 М трисНС 1 буфере (рН 7, 4) . Общий выход ТСГ составляет 603.Основными недостатками способов являются не высокий выход целевого продукта и получение его в комплексе с природным лигандом - тироксином, что может затруднить его дальнейшее исаользование.Целью изобретения является повышение выхода белка.Поставленная цель достигается тем, что в способе вьщеления тироксин , связывающего глобулина из сыворотки крови путем хроматографии, хроматографию осуществляют на сорбенте, представляющем собой матрицу, кова, Электрофорез в ПААГе в присутствии додецил сульфата натрия (ИЯ) также дал одну белковую полосу, При гель-фильтрации препарата на сефадексе Сбыл получен один симметричный пик. 55 1Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к выделению тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ),который может быть использован в качестве компонента диагностических наборов для определения ТСГ в крови человека.Известен способ выделения белковой смеси, связывающий тироксин, заключающийся в инкубации сыворотки или .плазмы крови человека с тироксином, ковалентно связанным с сефарозой, отмывке тироксин-сефарозы бикарбонатным буфером и элюции целевого продукта раствором щелочи, Целевым продуктом является белковая смесь, содержащая кроме ТСГ и другие тироксинсвязывающие белки (альбумйн и преальбумин), с выходом до 907 по ТСГ.Наиболее близким техническим,решением является способ выделения ТСГ, заключающийся в аффинной хроматографии плазмы крови человека на трииодтиронинсефарозе. После отмывки матрицы от неспецифически связанных белков О, 1 М барбиталовым буфером (рН 8,6), содержащим 1 М ЯаСЙв 0,1 Мтрис-НС 1 буфере (рН 8, б), содержащим 2 М ЯаСв О, 05 М натрий-фосфатном буФере (рН 6,8) и содержащим 2 М . ВаС В в О, 1 М трис-НС Е буфере (рН 8,6), элюцию целевого продукта осуЩествляют раствором тироксина (100 мг/л) в 0,1 М трис-НСЙ буфере (рН 8,6). лентно связанную с тироксином, споследующей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем растворомхолата натрия, элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 й очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере.1 л ретроплацентарной сывороткиперемешивают в течение 6 ч при 18 Ссо 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмоль коньюгированноготироксина на 1 мл сефарозного геля,что создает концентрацию тироксина1-10 " М. Аффинный сорбент отделяютпутем Фильтрования суспензии на пористом фильтре и промывают 1,5 лО, 1 М ИаНСО (рН 8,6) . Гель переносят на колонку с пористым стеклянным фильтром и отмывают 100 мл 12 мМраствора холата натрия, а затем 0,1 Мраствором ВаНСО 5 (рН 8,6) до получения элюата с постоянной плотностьюна 280 нм. Элюцию целевого продуктаосуществляют при комнатной температуре 0,001 М ЮаОН (рН 10,8). ВыходТСГ составляет 36 мг или 907Хроматография на гидроксиаппатиъе.Полученные из ретроплацентарнойсыворотки 45 мг аффинного элюата,содержащего 807 ТСГ в 20 мл щелочного раствора, диализуют против 0,005 М,натрий-фосфатного буфера(рН 7,0)и разделяют на две порции по 10 мл.Одну порцию аффинного элюата наносят на колонку с 15 мп гидроксиаппатита, уравновешенную 0,005 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,0), Гомогенный ТСГ элюируется в стартовом,буфере. Гидроксиаппатит регенерируютпромывкой 0,1 М натрий-фосфатным буфером, а затем 0,005 М натрий-фосфат"ным буфером (рН 7,0) и наносят вторуюпорцию. Количество выделенного ТСГсоставляет 30 мг или 843, Общий вы- .ход от содержания ТСГ в стартовойсыворотке составляет 753,Полученный данным способом препарат ТСГ содержал одну белковую полосу при электрофорезе в 5 и 7,57-номполиакриламидном геле (ПААГ) прирН 7,0, 8,3, 9,5..Заказ 3933/2 Тирак 343 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4 Молекулярная масса, полученная с помощью гель-фильтрации и ЗРЗ- фореза, составляла 54000-55000 Д.Константы ассоциации ТСГ с тироксином и трииодтиронином при 25 С 59 В 1 .имеют величины 2,510 и 2,0 10 И соответственно. Аминокислотный и моносахаридный составы хорошо корре-" лируют с данными других авторовРедактор П.Горькова Техред И.Ходанич 4Полученные физико-химические характеристики позволили судить о гомогенности препарата, полученногоданным способом.. Способ гарантирует двухстадийноевыделение гомогенного ТСГ с высокимвыходом и хорошей воспроизводимостью,при этом выход белка повышается с60 до 80"853.,