Способ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека

(51 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ В НЕКЛЕТОЧ НПЕРЕКИСНОЙ ДИСМУТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА Изобретение относится к способам получения перекисной дисмутазы и ее использованию для терапевтического лечения.Некоторые соединения имеют тенденцию к самоокислению. Все процессы само- окисления приводят к образованию токсичных промежуточных соединений восстановления кислорода, Самоокисление адреналина, пирогаллола и других соединений приводит к образованию перекисного радикала, Небольшая часть восстановления кислорода в митохондриях приводит к образованию перекиси, а в дальнейшем - перекиси водорода, Микросомная цитохромная Р 450 - система также высвобождает высший окисел.Перекись водорода образуется всегда, когда образуется высший окисел в результате реакции дисмутации. Большинство оксидаз в организме непосредственно восстанавливает кислород в перекись водорода.Ионизирующее излучение расщепляет воду с образованием атомов водорода и гидроксильных радикалов. Образующиеся та) Использование; генетическая инженерия, биохимия и способы получения перекисной дисмутазы, Сущность изобретения: способ заключается в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рРЯЗ- нео, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий .внеклеточную . дисмутазу, трансформируют полученной ДНК линии клеток СНО, культивируют трансформированные клетки с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 1 табл,ким образом.гидроксильные радикалы характерны для большей. части биологическихопасностей, к которым приводит ионизирующее излучение. В системе оксидазы ксантина, например, образуется не только высший окисел, но также перекись водорода, как непосредственно, так и в результате дисмутации высшего оксида. Эти соединения могут затем взаимодействовать с образованием гидроксильного радикала. Система оксидазы ксантина повреждает протеин ы. углеводы и нуклеиновые кислоты, а также убивает клетки, Из биохимических соединений полиненасыщенные липиды оказываются наиболее чувствительными к токсичному воздействию кислорода, Промежуточные соединения кислорода могут инициировать цепные реакции, включающие молекулярный кислород, так называемое окисление липида в перекисное соединение, Гидроперекиси липидов, образующиеся таким образом, и продукты их разложения не то ко наносят ущерб функциям клеточных м б 1779263 20ровали раствором 50 мМ фосфата натрия (рН 6,5), 0,25 М йаС 1. Фракции подвергали диализу против 25 мМ фосфата натрия рН 6,5, и концентрировали до обьема 2 мл.П р и м е р 6. Окончательная очистка ВК-ДВО на гепарин-Сефарозе.Четыре отдельные порции элюата из ДЭАЭ-Сефасела, полученные в соответствии с описанием, приведенным выше, разделяли одновременно на гепарин-Сефарозе. Растворы фермента, которые должны наносить на.колонну, подвергали диализу против 25 мМ фосфата калия, рН 6,5.20 мл геля гепарин-Сефароза промывали 25 мМ фосфата калия, рН 6,5, содержащем М НаС 1, а затем буфером без МаС. Гепарин-Сефарозу использовали для наполнения хроматографической колонны диаметром 2,5 см, а элюирование начинали с 25 мМ фосфата калия рН 6,5) со скоростью 15 мл/час. Раствор ВК-ДВО (примерно 10 мл, 800000 единиц) наносили на колонну и наблюдали поглощение при 280 нм, ВКДВО элюировали с использованием градиента МаС от 0 до 1,2 М КаС. Объем градиента составлял 400 мл. ВК-ДВО элюировали в три пика: один без сродства с гепарином, один с промежуточным. сродством и один с высокой степенью сродства. Эти пики соответствуют фракциям А, В и С, описанным в примере 2, После очистки с использованием описанной процедуры почти вся активность имеет тип С, и поэтому был сделан вывод, что он является видимо нативной формой фермента.Собранная активность составляла 430000 единиц (примерно 4,3 мг). Удельная активность соствляла 81100(ед, на мл/А 2 во), Собранная активность составляла примерно 537 ь от активности, нанесенной на гепарин-Сефарозу.П р и м е р 7, Аминотерминальная последовательность человеческой ВК-ДВО,Человеческую ВК-ДВО, полученную в соответствии с описанием, приведенным в предыдущих примерах, анализировали с целью идентификации ее М-терминальной) аминокислотной последовательности, Было установлено, что последовательность из первых ЗЗ аминокислот имеет следующий вид:ТВР ИНВ О 1.У С 1 0 АЯР ЯЕВ А.А О 0 РВОАЯй ЯЕВ АЯР ЯЕВА А О 1.0 ТВ Р 11 Е АВО АЯ Р М ЕТ ТУР А 1 А ОЯ ЧА 1 ТНВ С 1 011 Е ТВР ОЮ О 0 ЧА МЕТОМ Эта последовательность - или ее соответствующая часть - может быть использована для получения синтетических ДНК-зондов, синтетических деоксиолиго 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеотидов, комплементарных как к кодирующей, так и некодирующей нити ДНК-последовательности, кодирую щейаминокислотную последовательность, указанную выше,Такие зонды могут быть использованы вэкспериментах по гибридизации с кДНКбиблиотеками, синтезированными по иРНКиз В К-ДВ О-и роду ци рующих клеток или тканей для того, чтобы изолировать кДНК-копию полной длины или часть ВК-ДВО-гена всоответствии с описанием, приведенным впомещенном ниже примере.П р и м е р 8. Клонирование и формирование последовательности человеческойВК-ДВО,Получение ДНК-зонда,Человеческую ВЕ-ДВО подвергали очистке из пупочных канатиков в соответствиис описанием примеров 1-6. а последовательность первых 33 М-терминальных аминокислот определяли в соответствии сописанием примера 7, На основе этой аминокислотной последовательности синтезировали 48-мерный диоксиолигонуклеотид;5-САОООАСАТОТАТО ССААООТОАСТОАОАТСТООСАООАООТОАТОСАкомплементарный к кодирующей1нити ВЕ-ДВО-гена.Выделение кДНК плаценты человека,Восемь нитроцеллюлозных фильтров,на которые были помещены 20000 бляшекрекомбинантных фа гав, несущих кДН К-библиотеку на каждый фильтр, сначала пропитывали в 5 х КСН, а затем подвергалипредварительной гибридизации в течениеодного часа при температуре 41 С в 40 мл20 О формамида, 5 х раствор Денхардта, 50мМ фосфата натрия, рН 6,8 и 50,иг/млденатурированной, обработанной ультразвуком, ДНК бычьего тимуса. Далее фильтры гибридизовали с 32 р-меченым48-мерным-зондом, описанным выше, Гибридизацию осуществляли в растворе дляпредварительной гибридизации, в которыйдобавляли 100 р М АТФ (конечная концентрация) в течение 18 часов при температуре41 С, После инкубирования в течение ночипри температуре 41 С фильтры промывалиодин раз в 0,2 х КСН при температуре 37 С,а затем 4 раза промывали в 0,2 х КСН, 0,1ДСН при температуре 37 С и сушили навоздухе. Фильтры в течение ночи экспонировали на рентгеновской пленке. На каждом фильтре содержалось примерно 6положительных бляшек,Фаги с положительной реакцией гибридизации изолировали и подвергали очистке,а ДНК из этих фагов экстрагировали, Длину510 20 25 30 35 40 45 50 кДНК-вставок определяли при помощиэлектрофореза в агаровом геле после расщепления ДНК фага эндонуклеазой ЕсоВ 1,Рекомбинантный фаг, несущий самую длинну кДНК-вставку, обозначали через А ЯРЗ ииспольэовали в дальнейших исследованиях,кДНК-вставку фага 1 5 РЗ подвергалианализу эндонуклеазами и вставляли вДНКплазмиды р Ч С 18 и М 13-вектора гпр 9.Вставка из Л ЗРЗ содержала 1396 пар оснований (п.о.) кДНК и открытый для считывания участок, кодирующий протеин из 2401аминокислот, а также нетранслируемую 5 область в 60 п,о. и нетранслируемую 3 -об 1ласть в 607 п.о,Субклонирование и анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции кДНКвставок, кодирующих человеческуюВ К-ДВО.,Примерно 30 р г ДНК Л ЯРЗ переваливали эндонуклеазой Есо 81 и кДНК-вставкуотделяли от ДНК Л электрофорезом в 6 Ополиакриламидном геле, Приблизительно0,2,и г кДНК-фрагмента выделяли из геляпри помощи электроэлюирования, экстрагирования фенолом и хлорформом, и осаждения этанолом, 0,05 и г изолированногокДНК-фрагмента лигировали с 1,и г ДНК РЧС 18 по сайту Есой, ДНК после лигирования трансформировали в штамм Е. СоП НВ101. Трансформированные клетки подвергали селекции на пластинках, содержащихампициллин, Рекомбинантную плазмиду,несущую кДНК-вставку, идентифицировалии обозначили через р ЯЗ, ДНК плазмидыр 3 3 подвергали анализу при помощи эндонуклеаз,Анализ ДН К-последовательностикДНК, кодирующей человеческую ВК-ДВО,Последовательную серию перекрывающихся клонов кДНК-вставки формировали вМ 13-векторе пр 9, определяли полную нуклеотидную последовательность кДНК, приэтом было установлено, что она имеет длину1396 п.,о.Эта кДНК-вставка имеет открытую длясчитывания область в 240 аминокислот,Аминокислотная последовательность очищенного зрелого протеина начинается ваминокислоте +1, что наводит на мысль осуществовании сигнального пептида из 18аминокислот. Подобно известным сигнальным пептидам, эта последовательностьаминокислот богата гидрофобными аминокислотами и, кроме того, последним остатком является аланин, который являетсяодной из аминокислот, обнаруженной вэтой позиции в известных сигнальных пептидах. Аминокислотные последовательности были идентифицированы при помощи анализа пептидной последовательности,Еще одним отличительным свойством ДНЕ-последовательности является последовательность, обнаруженная в кодоне начала трансляции, == САОССАООС - , которая гомологична последовательности для эукариотных свойств начала, ССАСС - АИ/6/. Кроме того, возможный сигнал полиаденилирования с последовательностьюАТТААА-, гомологичной постулированной согласованной последовательности ААТААА, обнаружен через 14 п,о, в направлении вверх от конца полиаденилиования,Экспрессия человеческой ВК-ДВО в клетках СНО,Вектор экспрессии, содержащий начало репликации, ранний и поздний промоторы, последовательности полиаденилирования и окончания Вируса Обезьяны 40 (ЗЧ 40) использовали для продуцирования человеческой ВК-ДВО, закодированной в кДНК, описанной выше. кДНК длиной 1396 п.о. вставляли в единственный сайт Есой, расположенный между ранним промотором Я 40 и последовательностями полиаденилирования и окончания ЯЧ 40 так, что экспрессия кодирующей последовательности человеческой ВК-ДВО управляется ранним промотором ЯЧ 40, Сконструированную таким образом плаэмиду экспрессии ВК-ДВО обозначали как рРЯЗ.20 р г ДНК рРЯЗ расщепляли эндонуклеазой Рзт 1 в единственном сайте, расположенном в генер-лактамазы. Линеариэованную ДНК рРЯЗ подвергали трансфекции вместе с 0,5 А г ДНК из плаэмиды, содержащей последовательности, отвечающие за устойчивость к Генитицину (Гсульфат), в клетках СНО-К 1 (АТСС СС 61), Клетки после трансфекции подвергали селекции при помощи выращивания в среде (среда Ф 12 Хэмса, дополненная 10% сывороткой плода теленка, стрептомицином и пенициллином). содержащий 700 р.г на мл Генитицина, Колонии, устойчивые к Генитицину. изолировали и размножали в той же среде, Среду извлекали в определенные промежутки времени и анализировали на присутствие ВКДВО при помощи ЭЛИСА, а активность фермента измеряли в соответствии с описанием, приведенным ниже. Одну из полученных линий клеток обозначали через СНО-К/рРЯЗ Знеои отбирали для последующих исследован 1 йСекретирование ВК-ДВО в кл 1 урапьную среду клетками СНО, содепжэ цими ген, кодирующий человеческую ВК-ДВОКлон СНО-К 1/рР 53-неои родительские клетки СНО-К 1 выращивали в среде ФХэма, содержащей 10% сыворотку плода теленка, Спустя три дня среду удаляли, а клетки дважды промывали, инкубировали в растворе, содержащем 40 мМ трис-НС, 140 мМ КаС и 1 мМ ЭДТА. Извлеченные клетки (примерно 8 х 10) центрифугировали, верхний слой декантировали, а клетки хранили при температуре -80 С в виде осадка. Клетки разрушали ультразвуком в 1,5 мл раствора, содержащего 50 мМ фосфата К, рН 7,4, 0,3 М КВ, 3 мМ ДТПА, 0,5 мМ Ф М СФ и 100 ед/мл тразилола. Гомогенаты центрифугировали. Специальное оп ределение количества ВК-ДВО проводили при помощи инкубирования гомогенатов и культуральной среды с иммобилизованными антителами относительно человеческой ВК-ДВО и человеческой СцЕп ДВО. Никаких следова ВК-ДВО не было обнаружено в родительских клетках СНО К 1 или в их культу- ральной среде, Было установлено, что культуральная среда после клона клеток СНО-К 1/рРЗ 3 нео(15 мл) в этом конкретном эксперименте содержит 51 ед/мл ВКДВО, а всего 165 ед. Гомогенат клеток(в 1,5 мл) содержит 71 ед. ДВО-активности, из которой 20 ед. относится к ВК-ДВО. Таким образом, 97,5% ВК-ДВО в культуре СНОК 1/рРЯ Знеосекретировано в среду.Продуцирование человеческой ВК-ДВО в клетках СНО,Продуцирование человеческой В К-ДВО этим клоном в случае, когда клетки выращивали на твердом носителе и в суспензии.1. Продуцирование ВК-ДВО клетками СНО-К 1/рРЯ Знео, выращиваемыми на твердых носителях.а) В колбу емкостью 175 мл прививали 4,5 х 10. клеток в 30 мл среды Ф 12 Хэма с 10% бычьей сыворотки, 2 мМ 1 -глютамина, стрептомицина и пенициллина. Клетки ин.кубировали при температуре 37 С в атмосфере 5% СО 2. Среду меняли каждые три дня, а концентрацию человеческой ВК-ДВО, секретированной в среду, определяли, Производительность человеческой ВК-ВО составляла 1,5 пг, клетку 1 24 часа , что устанавливали при помощи ИФА и определения активности фермента ВК-ДВО,б) На микроносители 4 мг/мл прививали клетки в среде Ф 12 Хэма, в которую добавляли 5% сыворотку плода теленка, 2 мМ-глютамина, стрептомицин и пенициллин,Клетки выращивали в колбе с мешалкой емкостью 500 мл при температуре 37 С в атмосфере 5% СО 2. При выращивании слившихся клеток культуру заменяли со скоростью 0,088 час Производительность человеческой ВКДВО составляла 0,50 пг плетку 24 часа2, Продуцирование ВК-ДВО клеткамиСНО-К 1/рРЗ Знео, выращиваемыми в5 суспензионной культуре,На среду обаемом 125 мл (среду Ф 12Хэма, в которую добавляли 10% сывороткиплода теленка, 2 мМ 1 -глютамина, стрептомицин и пенициллин) прививали 2 х 10 кле 10 ток/мл, Эту культуру инкубировали вовращающейся колбе при температуре 37 Св воздухе, содержащем 5% СО 2,Каждые три дня среду заменяли. Производительность человеческой ВК-ДВО соста 15 вила 0,65 пг клетку . чАнализы на обнаружение экспрессиичеловеческой ВК-ДВО,1. Анализ с иммуноадсорбентом, связывающим фермент (ИФА). На микротитро 20 ван н ые пластин ы наносили 100,и л науглубление раствор, содержащий 15 р г намл поликлональных антител 390 кролика анти-ВК-ДВО (пример 3) в 15 мМ гча 2 СОз, 35мМ йаНСОз, 0,02% К 2 йз, рН 9,6. После ин 25 кубирования в течение ночи при комнатнойтемпературе пластины промывали буферомПБС (10 мМ фосфата натрия, 145 мМ МаС,рН 7,2), инкубировали в течение 30 минутпри температуре.37 С, вносили 200,и л на30 углубление раствора, содержащего 3% (в/о)альбумина бычей сыворотки в ПБС и промывали в ПБС. Пробы в 100 й л разбавленнойсреды добавили в каждое углубление и инкубировали в течение 1 ч при 37 С, Пласти 35 ны промывали 1 ч при 37 С с 100 р л науглубление раствора, содержащего 8 р г намл моноклонального антитела мыши антиВК-ДВО в 3% альбумине бычей сыворотки вПБС. После промывки 5% Теином 20 в ПБС40 пластины инкубировали в течение 1 ч при37 С с коньюгированными пероксидазойантителами кролика анти-мыши в 3% альбумине бычьей сыворотки в ПБСПластиныпромывали 5% Твином 20 в ПБС и инкуби 45 ровали в течение 20 минут при комнатнойтемпературе в темноте с 100,и л на углубление раствора субстрата (50 мМ цитрата натрия. 100 мМ фосфата натрия, 0,04% (в/о)о-фенилен диамина, 0,01% Н 202, рН 5,0),Реакцию прекращали добавлением 25,и л10% ДСН на углубление и измеряли погло- .щение в области 450 нм. 2. Определение активности фермента ВК-ДВО,Пробы анализировали перед и после их обработки анти-человеческой ВК-ДВО, иммобилизованной на Сефарозе (пример 4), В качестве активности ВК-ДВО брали раз5 10 15 20 25 35 40 50 55 ность между активностью пробы перед и после адсорбции антителами.П р и м е р 9, Индуцированное гапарином высвобождение ВК-ДВО в плазме крови человека,200 ед/кг веса тела гепарина инъекцировали двум здоровым мужчинам, голодавшим в течение ночи (а) в возрасте 34 лет и б) в возрасте 40 лет, Пробы крови брали перед инъекцией гапарина и с равными интервалами после инъекции. Пробы крови вводили в вакуумные трубки типа Терумо Веноджект, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, и затем подвергали центрифугированию, После центрифугирования пробы плаэмь 1 хранили при температуре 80 С до проведения анализа,Кроме того, 20 мл цельной крови бралиу трех здоровых человек и хранили в трубке с ЭДТА, как это было описано выше, Эту кровь делили на две равные части и в одну из них добавляли 30 ед, гепарина/мл, а в другую равный объем 0,15 М МаС. После инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре пробу подвергали центрифугированию и плазму собирали для ДВО-анализа,ДВО-активность анализировали при помощи и рямого спектрофотометрического метода с использованием КО 2. Одна единица ДВО-активности соответствует 8,3 нг человеческой Сц 2 п ДВО, 8,8 нг человеческой ВК-ДВО и 65 нг бычей Мп-ДВО. Отличие между изоферментами в плазме усиливают при помощи антител относительно человеческой Со 2 п ДВО и ВК-ДВО, иммобилизованных на Сефарозе 4 Б.Внутривенная инъекция 200 ед. гепарина на кг веса тела приводит к быстрому трехкратному увеличению ВК-ДВО-активности в плазме, Максимальное увеличение получали спустя 5 минут. Активность остается высокой в течение 15-30 минут, а затем постепенно снижается и достигает первоначального уровня через 6 часов. Ввведенный внутривенным способом гепарин не оказывал никакого влияния на активность Со 2 п ДВО плазмы и на активность ДВО устойчивости к цианиду, Возрастающие дозы гепарина приводят к увеличению высвобождения ВК-ДВО.Вопреки результатам, полученным в живом организме, добавление гепарина в цельную кровь, не оказывало какого-либо влияния на активность ВК-ДВО в плазме, Даже добавление гепарина (5 ед,/мл) непосредственно в плазму не приводило к каким- либо изменениям в а ктив ности В К-ДВ О, Эти результаты указывают на то, что увеличение активности ВК-ДВО в плазме живого организма не связано с каким-либо высвобождением фермента из кровяных клеток или активацией ВК-ДВО. содержащейся в плазме,Пробы плазмы 5 здоровых людей(3 мужчины, 2 женщины) подвергали хроматографическому анализу на гепарине-Сефарозе при комнатной температуре в колоннах, содержащих 2 мл гепарина-Сефарозы с 25 мМ фосфата калия, рН 6,5, в качестве элюента, Пробы (2 мл плазмы) вводили со скоростью 4,2 мл/час, а когда Арво достигал координатной оси, граничные компоненты элюировали при помощи линейного йаС 1-градиента в буфере фосфата калия (0-1 М, общий объем 50 мл) со скоростью 9 мл/час. Средний выход ДВО-активности в элюате составил примерно 95;,Перед нанесением пробы плазму уравновешивали буфером элюирования с целью хроматографии на небольших колоннах типа Сефадекс Г 15, Хроматография приводила к трехкратному разбавлению проб, Извлечение ДВО-активности было близко к 100%.Результаты определения фракций А, В и С ВК-ДВО в пяти видах нормальной плазмы приведены в табл, 1, помещенной ниже. Было установлено, что эти три фракции приблизительно составляют равные части в нормальной плазме. Средний выход ВКДВО-активности на хроматограмме составлял 95%, Разделение на три фракции очевидно не происходит за счет вторичного разрушения в лабораторных условиях. так как структуры для каждого типа плазмы одинаковы как перед, так и после хранения в течение 3 дней в холодильнике. Внутривенная инъекция гепарина пациенту приводит к существенному увеличению только фракции С, Фракции А и В остаются без изменений, У второго испытываемого пациента(эти данные не приведены) влияние иньекции гепарина было по существу идентичным, Фракция С увеличивалась от 7 до 32 единиц/мл плазмы,Эксперименты, описанные выше, показывают, что внутривенная инъекция гепарина приводит кбыстрому увеличению ВК-ДВО-активности в плазме. Гепарин не активирует ВК-ДВО, поэтому никакое высвобождение из клеток крови не может быть доказано, а это наводит на мысль, что поверхности клеток эндотелия являются наиболее вероятным источником высвобожденной ВК-ДВО. Несколько других факторов, имеющих сродство с гепарином, липопротеиновая липаза, печеночная липаза. диамин оксидаза и тромбоцитный фактор 4 ранее были подвергнуты аналогичному анализу и.было установлено, что при помощи внутри- венной инъекции гепарина наблюдается их быстрое высвобождение, В большинстве этих случаев ясно, что индуцированное гепарином вытеснение протеина из сульфата гепарина на поверхности клеток эндотелия является объяснением этого явления, Весьма правдоподобно, что высвобождение ВКДВО можно объяснить теми же эффектами.Никаких пиков в высвобождении не было получено при введении гепарина в дозах до 200 ед/кг.веса тела, это показывает, что для максимального высвобождения ВКДВО необходимо больше гепарина, чем для липопротеиновой липазы, диамин оксидаэы, печеночной липазы и тромбоцитного фактора 4, Отношение между сродствам для гепарина с сульфатом гепарина может быть ниже для ВК-ДВО, чем для других протеинов,Основная плазма человека содеркит почти равные количества фракций, А, В и С ВК-ДВО, Внутривенная инъекция гепарина приводит к высвобождению только фракции С с высоким сродством к гепарину, которая, ,очевидно, является формой. имеющей сродство к поверхностям клеток эндотелия, Здесь, достигали 4-6-кратное увеличение, но весьма правдоподобно, что более высокие. дозы гепарина приводили бы к более высоким пропорциям. Намного более высокие пропорции достигали для липопротеиновой липазы, печеночной липазы, диамин оксидаэы и тромбоцитного фактора 4, По сравнению с этим протеинами эндотелиальное связывание ВК-ДВО оказывалось намного слабее. Видимо, для фракции С ВК-ДВО имеется равновесие между плазмой и поверхностями клеток эндотелия, Большая часть ВК-ДВО в сосудистой системе оказывается расположенной на поверхностях клеток зндотелия,Молекулярные основы отличия относительно сродства с гепарином между фракциями А, В и С ВК-ДВО пока не установлены, Аминокислотный и более подробный составы отличаются не очень сильно, Нельзя было также обнаружить каких-либо антигенных различий. Связывание с отрицательно заряженным гепарином, очевидно, не носит общей ионообменной природы, так как никаких различий между фракцией А и С не обнаружено при помощи ионообменной хроматографии и, кроме того, их изоэлектрические точки идентичны (рН 4,5),Большинство типов клеток организма содержит сульфат гепарина и другие сульфатированные глюкоэоаминогликаны на своих поверхностях. Возможно, что большая часть ВК-ДВО, содержащейся в тканях, 10 25 30 50 ной ВК-ДВО на гепарине-Сефарозе 55 15 20 40 45 расположена на субстанциях клеточныхмембран и соединительной ткани. П р и м е р 10, Инъекции 1251-меченойчеловеческой ВК-ДВО кроликам ВК-ДВО пупочных канатиков метили иодом. Локализацию обнаруживали на хроматограмме в том же месте, что и для немеченной В К-ДВО; этот факт показывает,что молекулярный размер не менялся,Полученную в результате меченую ВК-ДВО подвергали хроматографии на гепарине-Сефарозе. Для последующих экспериментов испольэовали только материал, обладающий высоким сродством к гепариНу.Меченую ВК-ДВО вводили внутривенным способом кроликам, брали пробы крови с тем, чтобы определить радиоактивность, оставшуюся в плазме. Пробы плазмы осаж дали с использованием трихлоруксусной кислоты, а радиоактивность определяли в протеиновых осадках, которые получали центрифугированием, Кроликам давали иодид в воду для питья с тем, чтобы предотвргтить повторное введение метки в протеины в живом организме,С тем, чтобы изучить действие гепарина, через различные промежутки времени кроликам вводили внутривенным способом гепарин (2500 ед.), 10000 соответствует радиоактивности, которое плазма должна теоретически содержать при предположении,что общий объем плазмы у кроликов составляет 5 от их общего веса (например, кро-. лик весом 3 кг содержит 150 мл плазмы),После инъекции меченой ВК-ДВО обнаруживается быстрое снижение активности в течение 5-10 минут на примерно 15)ь от теоретического максимума. Когда делали инъекцию гепарина до введения В К-ДВО, то почти вся ВК-ДВО активность сохранялась, имело место только медленное ее снижение. Когда гепарин вводили спустя 2, 5, 10 и 20 минут после введения 125 1-ВК-ДВО, то Имело место быстрое увеличение радиоактивности и в области пика достигался теоретический максимум.П р и м е р 11. Анализ нативной ВКДВО пупочных канатиков и рекомбинантПримерно 500 единиц(4,4,и г) нативной ВК-ДВО С и рекомбинантной ВК-ДВО подвергали хроматографии на гепарине-Сефарозе, как это описано в примере 9. Было установлено, что оба фермента элюируются при 0,52 М в градиенте МаС 1, Таким образом, нативная и рекомбинантная ВК-ДВО ведут себя идентично и этот результат показывает, что рекомбинантная ВК-ДВО имеет С-тип.П р и м е р 12. Содержание меди и цинка в молекуле В К-Д В О.Содержание меди и цинка в нативной ВК-ДВО пупочных канатиков и рекомбинантной В К-ДВО определяли при помощи методов атомной спектрометрии поглощения в графитной горелке на установке Перкин-Элмер Химан 303+ ХГА, Сравнивали количество протеина ВК-ДВО, меди и цинка в йрепарациях, Было установлено, что один моль нативной ВК-ДВО (тетрамера) содержит 3,97 моля меди и 4,50 моля цинка. Рекомбинантная ВК-ДВО содержит 3,98 моля меди и 4,45 моля цинка на моль фермента. Результаты подтверждают, что молекула ВК-ДВО содержит четыре атома цинка.П р и м е р 13, Получение моноклональных антител против человеческой ВК-ДВО,Мышам делали инъекции ВК-ДВО С, полученной из пупочных канатиков (примеры 4 - 6), Спустя несколько месяцев, мышам делали инъекции ВК-ДВО три дня подряд. На четвертый день селезенки удаляли и измельчали. Клетки селезенки сливали с линией клеток миеломы в соответствии со стандартными приемами. Клоны, продуцирующие анти-ВК-ДВО, идентифицировали посредством техники ИФА, а затем подвергали субклонированию, Чтобы получить антитела в больших количествах клоны "14, В 7" и "6, Нб" выращивали в брюшной полости мыши, Антитела изолировали из асцитной жидкости при помощи адсорбции иэ Протеина А-Сефарозы.П р и м е р 14. Иммобилизация моноклональной анги-ВК-ДВО на Сч ВЗ-активированной Сефарозе,"6, Н 6" моноклональное антитело связываетн-ВК-ДВО очень прочно (КД10 М), Антитело "14. В 7" (Кд 10 М) выбрали для очистки ВК-ДВО, Перед связыванием с СчВг - активированной Сефарозой азид в цО растворе должен быть удален, а буфер должен быть заменен на "соединяющий буфер" (0,1 М карбоната натрия, рН 8,3, 0,5 М МаС 1), Эту стадию осуществляли на клонне типа ПД 10. СКВг - активированной Сефарозе давали возможность разбухнуть, добавляли в раствор цО (в соединяющем буфере) в количестве 2 мг ц 6 на мл геля, инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 2 часов на "вибраторе". Буфер удаляли и анализировали на оставшийся протеин. Было получено более 97 О связывание. Оставшиеся активные группы на цб - связывающем геле блокировали 1 М этаноламином при рН 9,3 в течение 2 ч при комнатной температуре. Избыток этаноламина и адсорбированный протеин смывали попеременно "соединяющим буфером" и 0,1 М101520 25 30 35 40 45 50 55 центрифугирования. Этот результат сравнивали с аналогичным инкубированием с использованием Сефарозы 4 В.В 1 мл ВК-ДВО в "соединяющем буфере" добавляли 10, 50, 100 и 1000 р л 50; суспензии моноклональной анти-В К-ДВОСефарозы, инкубировали в том же буфере 80 О суспензии Сефарозы ХБ при комнатной температуре в течение 3 часов, центрифугровали, оставшиеся ВК-ДВО-активности определяли в верхнем слое. Используя полученные цифры, можно расчитать, что связывающая ВК-ДВО способность геля составляет примерно 6000 единиц ВК-ДВО на мл 50% суспенэии геля ( 12000 ед/мл геля). Эта цифра равна примерно 6 теоретической максимальной связывающей способности и близка к той, которую в общем случае достигаются при использовании случайно связанного цб.П р и м е р 15, Изоляция рекомбинантной ВК-ДВО при использовании на начальной стадии моноклональной анти- В К-ДВО-Сефа розыПроцедуру очистки целиком осуществляли при температуре+4 С, % литров среды из культуры веток СНО-К 1/рРБнео, содержащей Зб единиц ВК-ДВО-активности ( 2,6 р г) на мл, центрифугируют с тем, чтобы удалить любые клеточные осколки и осадки, С тем, чтобы связать ВК-ДВО в среде (" 1500000 единиц), испольэовали примерно 125 мл моноклональной анти-ВК-ДВО-Сефароэы. 90-Сефарозой заполняли хроматографическую колонну диаметром 5 см и высотой примерно 6,5 см, Колонну промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, 0,5 М йаС 1; рН 7,0, перед "нанесением пробы". Культуральную среду наносили на колонну и наблюдали поглощение в области 280 нм, Протеины, слабо связанные с цО-Сефарозой, элюировали раствором 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, 0,5 М МаС 1, Далее колонну промывали 650 мл 50 мМ АМП (1-аминометил-пропано/- НС 1, рН 9,0), а ВК-ДВО элюировали 50 мМ АМП-НС 1, рН 9,0,1 М КИСА, собирали ВКДВО-активность, На следующей стадии всю порцию раэба вля ли 14 объемами дистилл ированной воды ититровали до рН 8,5 с исацетатом натрия, рН 4,0, 0,5 М МаС 1, и так четыре-пять раэ. Гель хранили в растворе 50 мм фосфата калия, рН 7,4, 0,5 М насв 0,02 М 2 йэ. Максимальную связывающую5 способность моноклональной ц(-Сефарозы определяли инкубированием в течение 3 ч в избытке очищенной ВК-ДВО и последующего анализа оставшейся ВКДВО-активности в верхнем слое послепользованием 2 М АМП, Извлечение на стадии 3 дб - сродство составляло 60;,10 мл ДЭЛЭ-Сефасела промывали 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, упаковывали в хроматографическую колонну (0,5 х 5), Разбавленную порцию ВК-ДВО из,цб - колонны наносили на ДЭАЭ-Сефасел, колонну промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, рН 8,5, до тех пор, пока поглощение в области 280 нм не станет близким к нулю. Элюцию проводили раствором 50 мМ фосфата натрия,.рН 8,5, 0,25 М МаС. Фракции собирали, подвергали .диализу против 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5. концентрировали до объема 6 мп. Выход на этой стадии составил 100;.ВК-ДВО подвергали очистке на гепарине-Сефарозе. 12 мл гепарина-Сефарозы подготавливали и промывали 5, мМ фосфатом натрия, рН 6.5, 1 М Г 4 аО.а затем 50 мМ фосфатом натрия, рН 6,5 и заполняли колонну. Концентрированную и отдиализованную фракцию (6 мл с ВК-ДВО-активностью примерно 185000 ед/мл) наносили на колонну, наблюдали поглощение в области 280 нм, Элюирование начинали с 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, когда поглощение в области 280 нм приближалось к координатной оси, ВК-ДВО элюировапи градиентом йаС от 0 М до 1 М. Объем градиента составлял 270 мл. Для того, чтобы защитить ВК-ДВО от воздействия высокой ИаО концентрации, фракции разбавляли (с начала подачи градиента) дистиллированной водой, Т.-трубку вставляли в пластиковую трубу из выходного конца колонны и дистиллированную воду закачивали в элюирующую жидкость с объемной скоростью, превышающей в два раза скорость элюирования колонны,ВК-ДВО-активность элюировали при той же концентрации КаС, что и С-пик в примере 6. В центре этого пика эпюат собирали (порция 1), Удельная активность порции 1 (ед/мл .разделенное на АД 2 яо) составила 88400, Удельная активность нативной ВК-ДВО, полученной иэ гомогената пупочного канатика (см. пример 1) при помощи такой же процедуры, составила 88200., П р и м е р 16, Определение молекулярного размера нативной ВК-ДВО и рекомбинантной ВК-ДВО при помощи гелевой хроматографии.Молекулярный вес нативного фермента . из пупочных канатиков и рекомбинантного фермента оценивали при помощи гель-хроматографии на Сефакрил С. Калибровку колонны проводили при помощи ферритина (440000), цб (150000), альбумина бычей сыворотки (7600 С), яичного альбумина (43000), химотрипсиноена (25000) и рибонуклеазы(13700) (молекулярные веса указаны в скобках).Нативную и рекомбинантную ВК-ДВО элюировалииэ колонны в положениях, соответствующих мол, м. 136000 и 151000, соответственно. Таким образом, рекомбинантная ВК-ДВО оказалась несколько больше, Часть такого отличия может быть вызвана частичной деградацией субблоков нативного фермента, как это можно видеть в ДВО-ПАГЕ-экспериментах, описанных ниже (пример 17),П р и м е р 17, Анализ нативной В К-ДВО пупочных канатиков и рекомбинантной ВКДВО электрофорезом в градиентном полиакриламидном геле,25,и г каждого фермента сушили вымораживанием, растворяли в 50 р г смеси пробы, содержащей 5% сахарозы. 5 мМ ЭДТА, 52-меркаптоэтанола и 2 О ДСН в буфере, состоящем из 0,4 М борной кислоты и 0,41 М Трис, рН 8,64. Пробы кипятили 5 мин и сразу ке охлаждали на льду, 1 р л (примерно 0,2 и г) каждой пробы наносили на градиентный(10-15 О) попиакриламидный гель и разгоняли в электрическом поле, окрашивали в Кумаси, Рекомбинантная ВК-ДВО имеет одну полосу с мол. м. примерно 32000. Нативная ВК-ДВО имеет две полосы, та, чтобольше, имеет очевидно тот же молекулярный вес, что и рекомбинантная ВК-ДВО, а та, что меньше, имеет мол. м, примерно 28000, что, вероятно, вызвано частичной деградацией фермента.П ри м е р 18. Сравнение между аминокислотным составом нативной и рекомбинантной ВК-ДВО и аминокислотная последовательность, полученная из кДНК- последовательности, кодирующей ВК-ДВО,Аминокислотный состав нативной ВКДВО пупочных канатиков и рекомбинантной ВК-ДВО (триптофан не включен в это сравнение, так как он не может быть надежно получен в аминокислотном анализаторе)показал, что нативный и рекомбинантный ферменты почти идентичны по своему составу, Совпадение с числовыми данными, полученными из кДН К-последовательности, также очень хорошее, Эти результаты ука 50 зывают на то, что нативный и рекомбинантный ферменты в сущности идентичны и что аминокислотная последовательность, полученная иэ кДНК-последовательности, является правильной,55 Формула изобретенияСпособ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека, заключающийся атом, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рРЯЗ-нео 18, содержа36 1779263 Разделение ВК-ДВО-плазмы на фракции А, В и С ВК-ДВО, ед/мл плазмы Составитель Т.ЗабойкинаРедактор З.Ходакова ., Техред М.Моргентал Корректор С,Лисина Заказ 4204 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 трансФормируют полученной ДНК линии клеток СНО, культивируют трансформированные клетки с последующим выделениеми очисткой целевого продукта, 1779263ран, но могут также повреждать другие компоненты клеток.Организмы, живущие в присутствии кислорода, были вынуждены в процессе эволюции создать несколько защитных механизмов против токсичных метаболитов восстановления кислорода. К защитным факторам относятся дисмутазы высших окислов (ДВО), которые подвергают дисмутации радикал высшего окисла, и содержатся в относительно. постоянных количествах в клетках ткани млекопитающих. Самым известным из этих ферментов является ДВОСцЕп, который является димером с молекулярным весом 33000, содержащим два атома меди и два атома цинка. ДВОСоЕп обнаружен в цитозоле и в межмембранном промежутке митохондрин. ДВО-Мп является тетрамером с молекулярным весом 85000, содержащим 4 атома Мп, и он сосредоточен главным образом в митохондриальной матрице. До последнего времени предполагали, что внеклеточнь 1 е жидкости не обладают ДВО-активностью.Недавно. установлено присутствие дисмутазы высшего окисла во внеклеточной жидкости (например, плазме крови, лимфе, синовиальной жидкости и цереброспинальной жидкости), которая была названа ЕСЯОО (ВК-ДВО), внеклеточная дисмутаза высшего окисла), У человека активность на мл плазмы составляет менее 1 ф от общей ДВО-активности на г ткани, но она видимо активно регулируется организмом, Сходство с лектинами указывает на то, что в отличие от ДВО Сш.и этот фермент является гликопротеином, Он видимо состоит из четырех равных нековалентно связанных субъединиц с общим (тетрамерным) молекулярным весом 135000 с содержанием металлов: один атом Сц и один атом Еп на одну субъединицу. Фермент катализирует дисмутацию первого порядка радикала высшего окисла, как это делают другие ДВО, содержащие Сц.,дво02 . + 02, + 2 Н -+ 02+ Н 20Удельная активность является очень высокой и, видимо, объясняется наличием четырех атомов Сц в молекуле, При хроматографии на гепарин-Сефарозе этот фермент разделяется на три фракции, А - без какого-либо средства, В - со слабым сродством и С - с сильным сродством относительно гепарина, В отличие от поведения ВК-ДВО, ДВО-СцЕп и ДВО-Мп не связываются с гепарин-Сефарозой. Этот фермент обладает определенным гидрофобным характером, который может указывать на сродство с клеточными мембранами, Срод 55 1015 2025303540 4550 ство с гепарином часто указывает на сродство с сульфатом гепарина, который содержится на поверхности клетки., в частности, на эндотелии кровеносных сосудов, Следовательно, можно предположить, что ВКДВО частично локализована на поверхности клеток. а частично во внеклеточных жидкостях. Аминокислотный состав и анти- генная активность совершенно не похожи на те же показатели исследованных ранее ДВО-изоферментов, ИнформационнаяРНК, кодирующая ВК-ДВО, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, что указывает на то, чтоВК-ДВО является секретируемым протеином, и РНК, кодирующая ДВО-Сиоп, с другой стороны, не содержит такую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, Кроме того, аминокислотная последовательность ВК-ДВО отличается от аминокислотной последовательности других ДВО-изоферментов; как было установлено, ВК-ДВО содержитя в плазме всехисследованных видов млекопитающих, а также у птиц и рыб, Содержание варьируетв широких пределах от вида к виду, но внутривидовые вариации очень незначительны. В плазме грызуна содержится в 10 - 20 разбольше ВК-ДВО, чем в плазме человека, в которой содержится сравнительно мало ВКДВО, ВК-ДВО был также обнаружен во всех типах исследованной ткани животного. Втканях внутривидовые различия значительно слабее, Концентрация ВК-ДВО в тканях (единиц на грамм влажного веса) выше, чемконцентрация ВК-ДВО в плазме (единиц/мл) у человека, У грызунов ткань и плазма содержат приблизительно равные количества В К-ДВО.Активность ДВО делает их интересными кандидатами на использование в качестве терапевтических агентов с целью подавления токсичных эффектов высших окислов и других кислородных радикалов.Ввиду вышеупомянутой низкой концентрации ДВО-активности во внеклеточных жидкостях, компоненты во внеклеточнойжидкости и поверхности клеток являютсянаименее защищенными против радикалов высших окислов и других токсичных продуктов восстановления кислорода по сравнению с .внутренностью клетки, Таким образом, ВК-ДВО образует особенно интересный продукт для терапевтических применений в связи с внеклеточным образованием радикалов высших окислов.Важным аспектом изобретения является то, что оно относится к ВК-ДВО рекомбинантного происхождения, 1779283ДН К-последовательность, кодирующая Изобретение относится к способноу Р ВК-ДВО, или ее модификации или произ- репликации вектору экспрессии, которыи водные, как они были определены выше, содержит ДНК-последовательность;одиможет иметь природу комплементарной рующую ВК-ДВО, Непосредственно вниз ог ДНК(кДНК), т, е, она может быть "сконстру этой последовательности последовательирована" при помощи образования кДНК- ности, кодирующей ВК-ДВО) может содербиблиотеки на основе иРНК из клеток, жаться последовательность кодирующая продуцирующих ВК-ДВО, посредством из- сигнальный пептид, присутствие которого вестных стандартных приемов и векторов. гарантирует секретирование ВК-ДВО, эксЭксперименты с гибридизацией могут быть 10 прессированной клеткой-хозяина, в котозатемосуществленысиспользованиемсин- рую был введен вектор. Сигнальной тетических олигонуклеотидов в качестве последовательностью может быть, напри- зондов с тем, чтобы идентифицировать мер, следующая последовательность; кДН К-последовательность, кодирующую . ВК-ДВО. В качестве альтернативы ДНК-по -18 -10 -1 следовательность может носить геномную Ме 1 ЕенАа енСузегСузЕен енЕенД 1 аА природу, то есть, она может быть получена а 6 уАаЯегАзрАа непосредственно из клеточного генома, на- АТ 6 СТ 66 С 6 СТАСТ 6 Т 6 ТТССТ 6 ССТ 6 пример, при помощи отбора геномных по- СТССТ 6 Т 6 СА 6 СС 66 Т 6 ССТСЯ 6 АС 6 СС следовательностей, гибридизирующихся с 20 ТА 66 АСС 6 С 6 АТ 6 АСАСАА 66 АС 66 А ДНК-зондом, полученным на основе полной СТ 6 АССАСС 6 ТС 66 ССАС 6 АА 6 ССУТ 666 или частичной амнокислотной последова тельности ВК-ДВО, Для терапевтических Эта сигнальная последовательность соцелей предпочтительным вариантом явля- ставляет предмет настоящего изобретения ется ДНК-последовательность ВК-ДВО че и предполагается, что она может быть вставловеческого происхождения с тем, чтобы лена в направлении вниз от ДНК-последоизбежать неблагоприятных иммунных реак- вательностей, кодирую щих другиепротеины или пептиды с тем, чтобы обеспеДНК-последовательность может также чить секретирование полученных в резульиметь синтетическую природу. ДНК-после тате продуктов из клеток, довательность может быть смешанной, синтетической и геномной природы, Такой линией клеток является СНО- смешанной геномной и кДНК природы, или К 1/рРЗ Зпео, которая сдана 27 августа смешаннойкДНКисинтетическойприроды, 1986 г. в Европейское Собрание Культур полученнойлигированиемДНК-фрагментов 35 Клеток Животных под шифром хранения кДНК, геномной или синтетической приро- . ЕСАСС 86082701. ды (в зависимости от необходимости), причем ДНК-фрагменты содержат часть гена, Изобретение относится также к ДНК- кодирующего ВК-ДВО, эти процедуры вы- фрагменту, который кодирует ВК-ДВО и полняются при помощи стандартных при который содержит следующую ДНК-послеемов. довательность:-1 В -10 ИеГЬецА 1 вЬецЬецсувбе СувЬвцЬвцЬвцА 1 вА 1 ао 1 уА 1 вйв Авр АтостоосастАстототтсстосстастсстоасАассаатосстсаалс ТАСОАССОСОАТОАСАСААООАСООАСОАООАССОТСООССАСООАОССТО 1 +1 10 120 А 1 етгртг 61 идв йегд 1 е 61 иРгрдвиеегдв БегА 1 в 61 итг 11 еАг Ави ,ОССТООЯСОООСОАООАСТСООСООАОСССААСТСТОАСТСООСООАОТООАТССОАОАС сООАсстасссостсстОАОссосстсоооттОАОАстаАОссосстсАсстАОостста20 ЭО Аегтггдгвдтвив 1 тиг 61 и 11 етг 61 и 61 ииегдегигиАг дг Ав Авидврб.х АтотАсосслАаотсАсааАОАтстоасАООАООтсАтосАОсаасаааАсОАСОАСООс ТАсАтосооттссАотосстстАОАссотсстссАотлсотсоссассстастостассо74040 50 ТЬЬвцИ 1 вА 1 аА 1 аСуво 1 п 7 а 101 пРгое гА 1 атлгЬецАврЛ 1 аЛ 1 аа 1 лРоАг Я АсостссАсоссосстоссАоотосАОссотсооссАсостООАсоссосасАассссаа ТОСОАООТОСООСООАСООТССАСОТСООСАОССООТОСОАССТОСООСОСОТСООООССэоо 60 70вв в т Фв в иаииввъ СТОАССООСОТСОТССТСТТССООСАОСТТОСОССССОСассвиАОСТСОАСОС тв. САСТООССОСАОСАООАОААОгСРССОТСОААСОСООООСОСООРТТСОАОСТОСООАЪОАа7 1779263 8Во90дапеии 1 ии 1 увдеесотдси 1 иесодвпвесвесаесдс д 1 ас 1 ен 1 вив 1 нсвоспсссстсслаоосттсссОАссблсссОААсАбстссАассссбсслтсслсст слссАОСОООАССТСССОЛАОООСТООСТСООСТТбтСОАООТСООСОСбстлсатсСАСОТОбтС10 О 11 Освессщ 9 1, х х .:х а еи кю1,ихттссоослсстблосслбссстссслстсслссбб сссслстлсллссссстссссстсллбсссстсслстссстсссолссстслсотсбсссссботолтоттосссслссоослс480 120 1 ЗОРгон 1 вРго 01 пн 1 вРгос 2 улврРьеб 1 улвлРьел 1 ача 1 лг лв 61 Вегьецтгссослсссослослсссоассалсттссосллсттсбсоатссосблсбослбсстстббоосотооосотсотоооссссстсллоссоттоллососслоасостоссотсаололсс540 1 ао 150 ЬгЯТУгЛг А 1 ао 1 Ьецл 1 ал 1 аВегЬецл 1 аа Асотлссссосссссстбсссбсстсбстсосос тсслтсососооссоолссобсболассласасс Р гои 1 в ве г 11 ече 1 О 1 А гдл 1 а сссасАстссАтсстссбссссбсс ооосстслсотлсслсссосссссс 60060 170 а 1 Ча 1 Ча 1 Ивл 1 аб 1 уб 1 цлсрлвРЬецб 1 УА ТООТСОТССАСОСТООСОАООАСОАССТОООСС слсслбсАООтасбАссбстсстбстООАсссо дбтуо 1 улвло 1 иЛ 1 авегча 101 цСООСООСААССАООССАОССТССАСоссоссоттсстсссстсослсстс.арво 0 опа 1 уЛвпЛ 1 во 1 улсдлгднелл 1 ас вс вЧСОСОААСОСОСОССООССОосссттосссссоосссссолссоолсолсосл РгоатуЬец сссооостс ссослслсосссосссссслсЭ 20 210 1 ввег 01 цЛг 0 н увЬувЛгдЛгдАгдо 1 цйега 1 цСу Астслалбса".Алблласаасоссасолалссслота толатстсасоттсттсоссоссосостстссстслс 7620 отгрс 1 цЛг 001 пЛ 1 аЛгфб 2тсбблссоссАООсосббаллссстсасостссососсст 220ЬувЛ 1 ел 1 вф е еллссссоссталттсссасоолст Необходимо отметить, что эта последовательность включает кодирующую последовательность сигнального пептида,приведенную выше. Сигнальная последовательность простирается от акинокислоты - 518 до -1. Последовательность, кодирующаязрелый ВК-ДВО, начинается в аминокислоте +1,Клетки, продуцирующие ВК-ДВО, могутбыть идентифицированы иммуногистохимическим способом с использованием антител, направленных против ВК-ДВО или припомощи анализа на секретирование. ВКДВО в.среду, в которой культивируют специфичные клетки. 15Как уже было упомянуто выше, ВК-ДВОпроявляет сродство с гепарином, что указывает на сродство с сульфатом гепарина, илидругими гепариноподобными глюкозоиминоглюканами, содержащимися на поверхности клетки. в частности, на поверхностиклеток эндотелия, Таким образом, имеетсмысл индуцировать высвобожденсие ВКДВО с поверхностей клеток и тем самымобеспечить улучшенный выход ВК-ДВО вы ращиванием клеток в среде, содержащей гепарин или гепариновый аналог.ДНК-фрагмент, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую ВК-ДВО, вставляют в вектор, который вводят в клетку-хозяина, которую затем выращивают на соответствующей среде при подходящих условиях с целью осуществления экспрессии ВК-ДВО, далее ВК-ДВО изолируют. Средой, которую используют для выращивания клеток, может быть любая известная среда, пригодная для этой цели, но в нее обходимо добавить Со и/или 2.и, ВК-ДВО, экспрессированная клетками, может секретироваться, то есть проходить через клеточные мембраны, в зависимости от типа клетки и состава вектора, Если ВК-ДВО продуцируется внутри клетки, то есть не секретируется клеткой, то она может быть выделена с использованием стандартных приемов, включающих разрушение клеток механическими средствами, например, с использованием ультразвука или гомогенизации, или при помощи ферментных или химических средств с последующей очисткой, 1779263 10Для того, чтобы обеспечить секретирование, ДНК-последовательность, кодирующая ВК-ДВО, должна предваряться последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секретирование ВК-ДВО из клеток так, что по крайней мере значительная часть ВК-ДВО, экспрессированной в клетке, секретируется в культуральную среду и в дальнейшем может быть извлечена оттуда. Экспериментально было установлено, что часть секретированной ВК-ДВО содержится в среде, а часть ВК-ДВО присутствует на поверхности клеток. Таким образом, выражение "секретированный в культуральную среду" включает любой перенос ВК-ДВО через клеточную мембрану, заканчивается ли он в культуральной среде или на поверхности клетки. ВК-ДВО может быть извлечен иэ среды при помощи стандартных приемов, содержащих фильтрацию клеток и изоляцию секретированного протеина,Очистка ВК-ДВО возможна с помощью антител, которые используют для хроматографии по принципу сродства, Антитела могут быть либо поликлональными, либо моноклональными антителами, Предпочтительными в настоящее время являются моноклональные антитела, так как большая часть моноклональных антител, как было установлено, связывается с антигеном более слабо, чем смесь поликлональных тел, иэ чего следует, что десорбция может быть осуществлена при умеренных условиях с использованием слабых элементов.Кроме того, так как все 90 должны быть направлены против ВК-ДВР, гораздо меньшие количества матриць 1 антител надо будет использовать для адсорбции ВК-ВДО из биологического материала. Десорбция ВКДВО потребует меньшие объемы элюента. что упрощает процедуры элюирования, которые в настоящее время весьма трудоемки из-за больших объемов элюента, необходимых для проведения десорбции,Специфичность моноклональных антител относительно ВК-ДВО видимо выше, чем специфичность поликлональных антител, Элюат, таким образом, будет более чистым, что означает исключение одной или нескольких последующих стадий очистки, Это означает, что процедура получения будет упрощена, а выход будет выше для ВКДВО, что представляет собой важное экономическое преимущество,В большинстве случаев, особенно, когда используют поликлональные антитела для очистки ВК-ДВО, собранный элюат может быть абсорбирован на ионообменной1015202530 матрице с последующим элюированием ВКДВО-активности и сбором фракций, содержащих ВК-ДВО-активность. Последующая очистка собранного элюата может быть осуществлена при помощи нанесения его на хроматографическую колонку с матрицей, содержащей гепарин или гепариновый аналог, например, сульфат гепарина или любой другой сульфатированный глюкозоаминогликан, сульфат декстрана или другое, сильно отрицательно заряженное соединение, и последующего элюирования; далее собирают фракции, обладающие сродством с анализируемым материалом. мунные заболевания, сахарный диабет (инсулиновой природы), рассеянный склероз, жировая эмболия, расстройство дыхательной системы у взрослых, нарушение дыхательной системы у детей, кровоизлияния в мозг у новорожденных, ожоги, разрушающее воздействие ионизирующего излучения и канцерогенез,Таким образом, ВК-ДВО может найти по существу такое же применение, что и СцЕп - ДВО, терапевтическая активность которой изучена более подробно и обсуждается ниже,Однако, было установлено, что ВК-ДВО обладает несколькими свойствами, которые, как предполагается, делают ее особенно эффективной в терапевтических приложениях, Салоп - ДВО имеет низкий молекулярный вес(33000), что приводит к тому,35 40 45 50 что она быстро выводится из организма в результате фильтрации в клубочке в почках так, что в человеческом организме этот фермент имеет период полураспада примерно 20-30 минут. Предварительные эксперименты с ВК - ДВО неожиданным образом показали значительно более продолжительное время полураспада для ВК-ДВО, В,настоящее время этот факт частично обьясняется высоким молекулярным весом ВК-ДВО. равным 135000, который препятствует ес Изобретение относится к использованию ВК-ДВО с целью диагностики, профилактики или лечения заболеваний или нарушений, связанных с присутствием или образованием радикалов высших окислов,или других токсичных промежуточных соединений кислорода, образующихся из радикалов высших окислов,Примерами таких заболеваний или нарушений могут служить ишемия, инфарктмиокарда, почки, мозга или инфаркт кишечника. воспалительные заболевания, такие как ревматический артрит, панкреатит, в частности, острый панкреатит, пиелонефриты идругие типы нефритов, и гепатиты, аутоим 1779263 12выделению из организма в результате фильтрации в клубочке, а частично, тем, что ВКДВО, видимо, связывается с поверхностями .эндотелия клеток, о чем речь пойдет ниже, При терапевтическом применении ВК-ДВО этот фермент имеет время полураспада в человеческом организме не менее 4 часов, а возможно и больше.ВК-ДВО является в случае своего нативного окружения секретированным протеином и, таким образом, весьма правдоподобно, что он синтезируется для выполнения функций во внеклеточном пространстве (во внеклеточной жидкости или на поверхностях клеток), которые и позволяют ему проявлять свойства, которые особенно хорошо приспособлены для защиты компонент плазмы или внешней поверхности клеток от токсичных воздействий радикалов высших окислов или других радикалов кислорода, Эта точка зрения подтверждается, например, тем, что ВК-ДВО имеет слабо гидрофобный характер, который способствует ее связыванию с внешней поверхностью клеток, а тот факт, что этот фермент проявляет сродство с гепарином, указывает на сродство с сульфатом гендрина, который обнаружен на внешней поверхности клеток, Таким образом, оба эти свойства указывают на способность защищать ткань, см. примеры, в которых результаты подтверждают связывание ВК-ДВО с эндотелием кровеносных сосудов,ДВО-активность в терапевтических приложениях была подтверждена для следующих заболеваний или нарушений,При парентеральном применении СОЕп-ДВО проявлял активность в качестве противовоспалительного агента в ряде животных моделей воспалительных процессов, а также при воспалительных заболеваниях животных, У человека положительные эффекты ДВО были отмечены при ревматическом артрите и артрозах, при воспалении мочевого пузыря и других урологических заболеваниях, а также при осложнениях, вызванных в результате лечения ионизирующим излучением. В некоторых странах бычья Соуп - ДВО зарегистрирована в качестве лекарственного препарата Орготеин, Пероксинорм), который используют главным образом для лечения артритов и артрозов, при этом композицию применяют внутрь суставов.При парентеральном применении СцЕп-ДВО не воспринимается клеткой.Снап - ДВО, заключенная в липосомы, воспринимается клетками. Была подтверждена ее эффективность против заболевания Крона, заболевания Бечета, язвенных колитов, заболевания Ковальского и нежелательных эффектов радиационной терапии. Механизм противовоспалительной активности СоЕп - ДВО не совсем ясен, Прямая защита от кислородных радикалов, продуцируемых активированными лейкоцитами, была выдвинута в качестве гипотезы, Другая возможность заключается в предотвращении образования сильно хемотактических мате 10 риалов, вызванного перекисями,Другой областью применения ДВО является его использование в качестве защитного фактора против разрушения ткани, вызванного ишемией с последующим восстановлением кровотока, Если прерывается подача крови к ткани, то ткань медленно будет превращаться в некротическую. Макро- и микроскопический процесс разрушения в общем случае будет развиваться медленно, в течение нескольких часов, Если кроваток восстанавливается в ткани, например, через 1 ч, то вместо улучшения будет наблюдаться очень сильное ускорение разрушения ткани, Наиболее вероятно, имеется несколько причин для называемого пародокса восстановления кровотока, но кислородные радикалы, которые образуются в результате повторного появления кислорода в ранее ишемической ткани, вносят 20 25 свой вклад в это разрушение, Так как такие 30 радикалы являются в высшей степени короткоживущими и, следовательно, их трудно изучать непосредственно, их образование и воздействие могут быть проанализированы на основании защитного 35 воздействия различных "пожирателей", Защита тканей была подтверждена в моделях восстановления кровотока при ишемии или аноксии в почке,Результаты относительно ишемии и последующего восстановления кровотока 40 имеют потенциально важные клинические приложения. Может быть получен исключительно хороший эффект восстановления 45 кровотока в ткани в связи с инфарктами сердца в результате сопутствующего применения ДВО и/или других защитных факторов против кислородных радикалов и тромболитических факторов, например что ее можно испольэовать в связи с хирургией сердца и трансплантацией сердца, Аналогичным образом результаты применения ДВО в связи с ишемией почек с последующим восстановлением кровотока могут 55 быть использованы в связи с трансплантацией почек и трансплантацией других органов таких, как кожа, легкие, печень или поджелудочная железа. Заболевание ише 50 плазминогенного активатора ткани. Результаты экспериментов с ДВО указывают на то, 13 177926351015 20 25 30 35 40 45 50 мия головного мозга является еще одним возможным применением.ДВО обладают также другйми интересными защитными эффектами в связи с другими патологическими заболеваниями,Например, панкреатит был вызван в поджелудочной железе собаки тремя различными путями: вливание олеиновой кислоты, частичная закупорка выводного протока и ишемия с последующим восстановлением кровотока. Было установлено. что ДВО, каталаза и ДВО+ каталаза оказывают защитное воздействие, но в общем случае наиболее эффективным оказывается комбинированное лечение. Эти результаты указывают на возможность активной терапии против этого заболевания, для которого в настоящее время не существует специальной терапии,Было установлено, что лечение с использованием ДВО является эффективнымтакже при ожогах.Парентеральное применение СоЕп -ДВО предотвращает бронхолегочную дисплазию у преждевременно рожденных детей,страдающих от младенческих нарушенийдыхательной системы.В моделях с щенками гончей собаки было отмечено, что иньекция ДВО уменьшает частоту внутрижелудочн ых кровоизлияний головного мозга с последующим снижением кровяного давления.ДВО улучшает состояние крыс, страдающих гепатитом,Острое сильное увеличение кровяного давления приводит к функциональным и морфологическим нарушениям в артериолах головного мозга. Ингибиторы синтеза простагландинов и дисмутэза высших окислов предназначены для защиты против таких нарушений, Детальный анализ этой модели приводит к заключению, что радикалы высших окислов образуются в качестве побочных продуктов в процессе синтеза простагландинов, Эти результаты наводят на мысль, что повреждение тканей. вызванное радикалами высших окислов, которые высвобождаются в процессе синтеза простагландинов, может иметь место в других патологических ситуациях, и что ДВО может осуществлять защитное действие. При различных типах аутоиммунных заболеваний таких, как системный склероз и ревматический артрит. была отмечена более высокая частота хромосомных повреждений в лимфоцитах. Фибробластные культуры и прямые препараты костного мозга также иногда обладают более высокой частотой повреждений,Неопластическая трансформация клеток в общем случае разбивается на две фазы, а именно, на инициирование и последующее развитие, В лабораторных моделях, когда инициирование осуществляли при помощи ионизирующего излучения, блеомицина, мизонидазола и других нитроимидаэолов, онкогенную трансформацию эффективно ингибируют при помощи введения в среду ДВО. Причем нет необходимости в присутствии ДВО в процессе воздействия инициирующих материалов, что видимо указывает на то, что фермент ингибирует последующую стадию развития, Нетоксичные дозы ксантина + оксидаэы ксантина вызывают рост клеток, Добавление ДВО или ДВО + каталаэы ингибирует этот эффект, В модели, в которой кожные опухоли вызывали бензантраценом с последующим применением форболового сложного эфира (ТРА), при помощи локальной обработки липофильным комплексом меди с ДВО-активностью значительно снижали образование опухоли, Этот результат указывает на то, что по крайней мере в некоторых случаях радикалы высших окислов участвуют в образовании опухоли и что ДВО может осуществлять защиту против такого действия,Есть основания предполагать, что кислородные радикалы участвуют в неблагоприятных воздействиях токсичных материалов таких, как блеомицин, адриамицин, аллоксан, б-гидродопамин, паракват, дигидрофумаровая кислота, нитрофурантоин и стрепотозотоцин, В тех случаях, когда образование радикалов имеет место во внеклеточном пространстве, зто пространство может быть защищено при помощи инъекции защитного фермента, Так ДВО может защищать против диабетогенной активности аллоксана в лабораторных условиях и в живом организме. Таким образом, разрушающее воздействие аллоксана, видимо, осуществляется через воздействие радикалов высших окислов или других кислородных радикалов, полученных из него; Причина высокой чувствительности р-клеток к аллоксану не совсем ясна и можно только предполагать, что имеется какая-либо связь между чувствительностью к аллоксану и тяжестью заболевания сахарным диабетом(инсулинового типа). При сахарном диабете существуют инфильтрация в островках Лагерганса под воздействием воспаленных клеток, которые потенциально могут образовывать кислородные радикалы, Поэтому можно подположить. что защита -клеток при по 1779263 16мощи инъекций ДВО является первым шагом в борьбе с сахарным диабетом,В общем случае СоЕп-ДВО использовали в качестве испытываемого материала вэкспериментах, которые были описаны выше. Однако можно предположить, что ВКДВО можно использовать для тех же целей.Ранее было установлено, что ее можно использовать.с более высокой эффективностью благодаря ее специфичным свойствам,которые делают ВК-ДВО особенно притягательной для внеклеточного применения,П р и м е р 1. Получение гомогенатовпупочного канатика,Человеческие пупочные канатики собирали в палате для рожениц в госпиталеУниверситета в Умеа, Их хранили в холодильнике в палате, а затем быстро замораживали в лаборатории при температуре-80 С и хранили при температуре -30 С,После оттаивания пупочные канатикиизмельчали, суспендировали в 50 мл буферафосфата калия, рН 7,4, содержащего 0,3 МКВч, 3 мМ диэтилентриэминпентэуксуснойкислоты (ДТПК, 100000 м ед/д тразилолэ(апротинииа) и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), Использовали 4 л буфера на кг пупочных канатиковДляувеличения экстрагирования ВК-ДВО изткани (примерно в 3 раза) использовали хэ. отропную увеличивающую диффузию сольКВч. ДТПК, тразилол и ФМСФ добавляли стем, чтобы ингибировать протеазы, Эту суспензию в дальнейшем подвергали гомогенизации, обрабатывали ультразвуком,встряхивали при температуре 4 С в течение1 часа. Полученные в результате гомогенатыподвергали центрифугированию (6000 хц, 20мин), а верхние слои быстро замораживалипри температуре -80 С, хранили при температуре -30 С,П р и м е р 2, Получение и очисткаВК-ДВО легких человека,Извлекали легкие человека в течение 24ч после смерти при помощи вскрытия девяти трупов без каких-либо очевидных признаков заболевания легких, Легкие измельчалина куски, промывали в 0,15 М растворе Ма С,гомогенизировали в 5 объемах смеси ледвода, 50 мМ ацетата натрия, рН 5,5, Го. могенат обрабатывали ультразвуком,экстрагировали в течение 30 минут при температуре 4 С и центрифугировали(6000 х 9)в течение 20 минут,Верхний слой адсорбировали на ДЭАЭСефселе, уравновешенной 50 мМ ацетатомнатрия, рН 5,50, и элюировали градиентом0 - 200 мМ МаС в ацетатном буфере, Градиентный объем в 10 раз превышал объем колонки.25 щенной относительно фосфатного буфера, а 30 35 40 45 50 зы колонны подвергали диализу против 25 55 5 10 15 20 Активные фракции собирали, разбавляли 1,5 объемами дистиллированной воды и титровали до рН 8,4 с использованием 1 М раствора МаОН. Снова адсорбировали на ДЭАЭ-Сефаселе, уравновешенном 175 мМ трис НС, рН 8,4 ( объем ионообменного материала на 10 объемов фракции), Далее ДЭАЭ-Сефасел промывали буфером, заполняли им колонну и элюировали 0-200 мМ градиентным раствором йаС в Трис-буфере,Собранные фракции концентрировали и подвергали диэлизу относительно 150 мМ фосфата натрия при рН 6,5. Пробу наносили на колонну (примерно 1 мл геля на 15 мг протеина в пробе) с фенил-Сефарозой, уравновешенной относительно того же буфера. Эту активность элюировали градиентом 0 - 0,5 М КВч в 50 мМ фосфатэ натрия (рН 6,5),Активные фракции собирали, концентрировали и подвергали диализу против 0,15 М фосфата натрия, рН 6,5, Пробу наносили на колонну из Кон А-Сефэрозы, уравновезатем элюировали при помощи 50 мМ а-метил О-маннозида в фосфатном буфере,Активные фракции концентрировали, наносили на колонну и элюировали в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5,Активные фракции со стадии элюирования собирали, концентрировали и наносили на колонну из лектина пшеничных зерен Сефароза (10 мл), уравновешенную при помощи 0,15 М фосфата натрия, рН 6,5. Фермент элюировали 0,45 М М-ацетил-О- глюкозамином в фосфатном буфере,Активные фракции с описанной выше стадии собирали, концентрировали, подвергали диализу против 0,15 М фосфата натрия, рН 6,5, и наносили на колонну, содержащую голубую Сефарозу КЛБ, уравновешенную при помощи фосфатного буфера. После промывки колонны буфером подавали 10 мМ НАД и 10 мМ НАДФ, После промывки буфером пиридиновых нуклеотидов фермент элюировали 0,9 М КВч в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5,Активные фракции из голубой СефаромМ фосфата натрия, рН 6,5, и наносили на колонну. с гепарин-Сефарозой, уравновешенную тем же буфером, элюировали 140 мл градиента 0-1,0 М йаС в фосфатном буфере. Получали три фракции. Фракция А содержала УФ-абсорбирующий материал, который не связывался с гепарин-Сефарозой, Ее подвергали очисткена колонне с Сефакрил 8-300. Пробу элюировали в 25 мМ трис НС. рН 7,5,Фракция А, В и С подвергали диализуотносительно 25 мМ Трис НС, рН 7,5, азатем концентрировали до объемв 1 мл намембранных ультрафильтрах. Фракцию Сиспользовали для получения антител ВКДВО в соответствии с описанием, приведенным в помещенном ниже примере,П р и м е р 3. Кролику подкожнымспособом вводили 30 р г ВК-ДВО (фракциюС), вместе с полной добавкой Фрейнда, Далее иммунизацию ускоряли при помощи 5инъекций 30,и г ВК-ДВО в неполной добавке Фрейнда с интервалами в один месяц.Через 2 недели после введения последнейдозы кролику собирали кровь, 96-фракциюантисыворотки изолировали при помощиадсорбции и десорбции из материала Протеин-А-Сефароэа в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя,Элюирование осуществляли 0,1 М гпикоколНО, рН 3,0. Собранный 96 титровали прирН 7,0. После этого 96 подвергали диализупротив 0,1 М карбоната натрия (рН 8,3), 0,15М МаС (соединяющий буфер),96 разбавляли до концентрации 5-8мг/мл при помощи "соединяющего буфера".Добавляли Сефарозу, активированнуюСЙВ, инкубировали при встряхивании в течение ночи при температуре 4 С, Буфер от сасывали из геля и анализировали наоставшийся протеин. В общем случае получали более чем 980 связывание, Гель сосвязанным 90 блокировали суспензией в 1М этанопамина в течение ночи при температуре 4 С, промывали "соединяющим буфером", далее 0,1 М ацетата натрия (рН 4,0),0,5 М йаС, Гель хранили в "соединяющембуфере" с азидом в качестве антибактериального агента100 р л 500 суспензии анти-ВК-ДВОСефарозы добавляли к 0.5 мл ВК-ДВО в "соединяющем буфере". Осуществлялипараллельное контрольное инкубированиес использованием 100 р л 50 суспензииСефарозы 4 В, Растворы встряхивали в течение ночи при температуре 4 С, а затем центрифугировали. Остаточная активность врастворе, обработанном Сефарозой 4 В, была равна 2080 ед/мл, а в растворе, обработанном анти-ВК-ДВО-Сефароэой - 720ед/мл, Используя эти цифры, можно рассчитать, что 1 мл анти-ВК-ДВО-Сефарозногогеля связывает 13500 единиц В К-ДВО (примерно 120 /с г). Эти расчеты использовалидля составления плана адсорбции ВК-ДВОиз гомогенатов ткани человека. П р и м е р 4. Иммуноадсорбция ВКДВО в анти-В К-ДВО-Сефарозе.15 20 253035 404550 55 деляли от экстракта на стеклянной воронке, промывали 50 мМ фосфата калия (рН 7,0), 0,5 М МаС,Гель упаковывали в хроматографическую колонку, элюирование начинали с 50 мМ фосфата К (рН 7,0), 0,5 М МаС со скоростью 50 мл/час и фиксировали поглощение в области 280 нм. Элюирование продолжали до достижения очень низких значений при Арво. Далее ВК-ДВО эпюировали линейным градиентом КИСА 0,5 - 2,5 М в 50 мМ фосфата калия, рН 7,0. Общий объем градиента составлял 500 мл, а элюирование осуществляли со скоростью 30 мл/час, Десорбция ВК-ДВО протекала медленно и элюирование не могло быть ускорено,Элюирование ВК-ДВО не является полным в конце градиента 2,5 М КИСА. но эпюирование не продолжают с тем, чтобы не собирать ВК-Д,ВО, которая становитсяслишком денатурированной под действием высокой концентрации КИСА.Первую активность в градиенте не собирали, так как она содержала слишком большое количество примесей неспецифично связанного протеина (А 28 О),П р и м е р 5. Адсорбция и эпюированиеиз ДЭАЭ-Сефасела. В собранный элюат из колонны с антиВК-ДВО-Сефарозой добавляли 1-аминометиппропанол до конечной концентрации 10 мМ. Раствор титровали до рН 9,0 с использованием 1 М йаОН, разбавляли 5 объемамидистиллированной воды. В полученный раствор добавляли 40 мл ДЭАЭ-Сефасепа,уравновешенного 50 мМ фосфатом натрия, 0,5 М МаС, 175 мМ Трис-НС, рН 9,6,ВК-ДВО адсорбировали на ДЭАЭ-Сефаселе при перемешивании в течение ночи при температуре 4 С. ДЭАЭ-Сефасеп затем собирали на стеклянной воронке, промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, р Н б,5, и заполняли им хроматографическую колонну диаметром 2,5 см. Эту колонну сначала элюировали примерно 4 объемами вышеупомянутого буфера. Затем ВК-ДВО эпюиПриготавливали примерно 10 л экстракта пупочных канатиков в соответствии с примером 1, Содержание ВК-ДВО в экстракте составляло примерно 150 ед/мп, Если гель связывает 13500 ед/мл (см. пример 3), адсорбция всей ВК-ДВО в 10 мл экстракта требовала примерно 110 мл анти-ВКДВО-СефароэыЭкстракт подвергали центрифугирова 10 нию (6000 х, 30 мин), с тем, чтобы удалить осажденный протеин. Затем в верхний слойдобавляли 110 мл анти-ВК-ДВО-Сефарозы, смесь инкубировали в течение ночи при температуре 4 С при перемешивании. Гель от