Способ получения пероксидазы

(19) (И) 3(51) С 12 Н 9 08 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ц ТЕЛЬСТ АВТОРСКОМУ Ка зССР/022, 1979,тительной ткани, экстракцию фермента, Фракционирование экстракта. сульфатом аммония и его гель-фильтрацию,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения выхода Фермента,в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, содержащий МаС 1 в концентрации 0,490,51 М, и аскорбат натрия в концентрации. 0,029-0.,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменнуюхроматографию на карбоксиметилцеллюлоэе. или диэтиламиноэтилцеллюлозе.1108102 сульфатом аммония и его гель-фильт-рацию, в качестве растительной тканииспользуют листья полыни, для экстракции используют водный раствор,содержащий БаС 1 в концентрации 0,49.0,51 М, и аскорбат натрия в концентрации 0,029-0,031 М, а после .гель- .фильтрации проводят ионообменнуюхроматографию на карбометилцеллюлозе или диэтиламиноэтилцеллюлозе. О С целью увеличения выхода фермента в воду при экстракции добавляютИаС 1 (0,49-0,51 М), для предотвращения окислительного действия фенольных соединений добавляют аскорбат 15 натрия (0,029-0,031 М) . Это позволяет значительно повысить выход целевого продукта.П р и м е р 1. 70 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированнойводе с 0,5 М ИаС 1 и отжимают черезткань. Балластные белки осаждаютсульфатом аммония до 30-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 80-ного насыщения.Осадок отделяют центрифугированием,перерастворяют в ацетатном буфере(0,005 М, рН 4,4) и пропускают черезколонку с 6-,50. Затем проводят очистку на колонке с КМ-целлюлозой, Результаты выделения фермента представлены в таблице.1 1 Выход,Активность Степень очистки Общий белок, мг Общий объем, мл Стадии очистки общая удельная,мкмоль/минна 1 мг Растворисходный 20,1 4020 200 18 После6-50 4,7 94,8 8960 94,5 70 После КМ=52 150 65,6 3000 5880 1,96 1 пик 2 пик 2590 460 9250 0,28 10 П р и м е р 2. 70 г полыни гомоге,низируют вдистиллированной воде с ЯаС 1 (0,45 М) . Для осаждения балластных белков проводят высаливание балластных белков сульфатом аммония до 20-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость 60 добавляют сульфат аммония до 80-ного насыщения.Осадок отделяют центрифугированием, перерастворяют в ацетатном буфере (0,005 М, рН 4,4) и пропускают 65 Изобретение относится. к биохимии и может быть использовано для промышленного и лабораторного получения пероксидаэы.Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена С 11 и С 23Однако они не обеспечивают достаточно высоких выхода и активности фермента в силу длительности и многостадийности процесса выделения. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения пероксидазы, включающий гомогениэацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование .экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию Г 21.Однако способ характеризуется недостаточно высоким выходом фермента (удельная активность 1180 1340 Е/мг белка) . Целью изобретения является увеличение выхода и активности перокси. дазы.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения пероксидазы, включающему гомогенизацию, растительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта через колонку с 6-50. Фракции, проявляющие пероксидную активность, очищают на КМ-целлюлозе. Общий выход фермента 1,9 мг с активностью 2600 мкмоль/мин на 1 мг фермента.П р и м е р 3, 45 г полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,55 М ИаС 1. После удаления балластных белков, осаждаемых при 20-ном насыщении сульфатом аммония, ;проводят высаливание при 80-ном насыщении. Осадок отделяют центрифуги1108102 Составитель В,МуронецРедактор Т.Колб Техред А.Ач Корректор Д.Мельниченко Заказ 5838/18 Тираж 522 Подписное- ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП Патентф, г,ужгород, ул,Проектная,4 рованием и перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере рН 4,4) . Предвари. тельно обессоленный белок на колонке с 6-50 пропускают через колонку с КМ-целлюлозой. Общий выход белка 14,3 мг с активностью 1200 мкмоль/мин на 1 мг фермента.П р и м е р 4. 1 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,029 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и пропускают через олонку с сефадексом 0-50, Получают астично очищенный ферментный препарат с активностью 372 мкмоль/мин на 1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг.15 П р и м е р 5. 1 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде. Гомогенат фильтруют и пропус- кают через колонку с 6-50, Получают частично очищенный ферментный препарат с активностью 226 мкмоль/мин на1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг.П р и м е р 670 г полыни гомо. генизируют в дистиллированной воде с 0,51 М НаС 1 и 0,03 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и удаляют балластные белки высаливанием сульфатом аммония до 30-ного насы" щения. Супернатант высаливают сульфатом аммония до 80-ного насыщения. Полученный осадок перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 7,7) и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Пероксидаэа элюируется с колонки при концентрации МаС 1 0,5 М. Выход белка 15 мг с удельнойактивностью 1314 мкмоль/мин на 1 мг белка.Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение фермента пероксидаэы с высокими выходом и удельной активностью из доступного и дешевого сырья,