Натриевая соль -амино(метилтио)пропилфосфонил -5 аденилата для избирательного ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения

ОПИСАН И ЗОБР ЕТЕ Н г 673290 И Санга Советски Социалистическ Республик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 1) Дополнительное к авт. свид-в.07.77 (21) 250826123-0 явлен ием заявкизтрисоеди Ъсударственнын комит СССР(45) Дата опубликования описания 30.03.8071) Заявятел Институт молекулярной биологии АН СССР(5 НАТРИ ЕВАЯ СОЛЬ а-АМ И НОг-(МЕТИЛТИ О)- ПРО П ИЛфОСфО Н ИЛ-АДЕН ИЛАТА ЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКЕИ СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Настоящвому химичсоли смешфосфата (Апропилфосф ее изо е скому анного МФ) оново 1 я 10- Ф-Сно о белка в к летке и АМФ, там. Од- цфичныилтио)- ифичесого сое(метилдля изр ментов гэфиров З оретение относится к но- соединению - натриевойангидрида аденозин- и а-амино-у-(метилтио)- й кислоты формулы; ингибитору биосинтезаспособу ее получения.Известны эфиры аминоспиртовобладающие сродством к ферменнако они не являются высокоспецми ингибиторами ферментов.Натрневая соль а-амцно-у- (мепропилфосфонил-аденилата спеки тормозит активацию метионина.Цель изобретения - синтез нодинения, натриевой соли а-амино-,тио)-пропилфосфонил-аденилатабирательного ингибирования фбиосинтеза белка в клетке.Известен способ получения д фосфорной кислоты з присутствии диццклогексилкарбодицмцда с небольшим количеством воды. Однако этот способ для получения целевого продукта требует введения и снятия защиты с различных функциональных групп, что осложняет процес в связи с присутствием серусодержащцх соединений (инактивация катализатора реакции гцдрогенолцза) и лабцльностью ангцдрцдной связи. Способ получения натрцевой соли аамцно-у- (метилтцо) - пропцлфосфонцл - 5- аденилата, согласно изобретению, заключается во взаимодействии а-амино-г(метилтио)-пропилфосфоновой кислоты с АМФ в присутствии ДЦК в водном пиридине, содержащем соляную кислоту.П р и м е р 1. Натрцезая соль а-амцноу-(метилтцо) - пропцлфосфонцл - 5 - аденцлата.0,092 г (0,5 ллоль) а-амино-у-(мстцлтио)-пропилфосфонозой кислоты и 0,173 г (0,5,цло.гь) аденозцн-фосфата суспендцруют в 1,5 лд 1 н. соляной кислоты, прцоазляют 5 .ц.г пцрцдцца, затем раствор 2,06 г (10 ллоль) М,М-дцццклогексцлкарбодиимида в 8 лл пирцдцна и перемешивают 30 ч при 20 С, фильтруют, осадок промывают пцридцном (2 ХЗ л.г), водой (2:Зл.г) фильтраты упаривают з вакууме, добавля62 10 - 3 2 10 - 3 5 1 О Валил-тРНК-синтеазафенилаланссл-тРНК-с ин геазаМетионнл-тРНК.ситеаза ХГФ - адеиозинтрифасфат; фф: - пирофосфатн,1 й обсиен. сот 5 мл воды, фильтруют, фильтрат после извлечения эфиром размешивают с 5 г угля, Уголь отфильтровывают, промывают 100 м,г воды и млюируют 2%-ным спиртовым раствором тримтиламина. Злюаты упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 1 лсл метанола и добавляют раствор 0,06 г (0,5 ммоль) перхлората натрия в 1 мл метанола. Выпавший осадок отфильтрозывают, промывают спиртом и выделяют целевой продукт препаративным млектрофорсзом на бумаге ФНв буфере 0,05 М ацетат натрия, рН 4,1 при нап 1 ряжении 4000 В. Полосу с подвижностью +0,76 относительно АМФ млюируют при +4 - 4,5 С, млюат 15 лиофилизуют, остаток промывают абсолютным метанолом, эфиром и сушат в вакууме над Р,Оа. Выход натриевой соли а-аминас - (метилтио) - прапилфосфонил- аденилата 0,067 г (25,св), (/яма, = +0,76, 20 (в. = 13250, рН 7), На хроматограммах и млектрофарегр ам мах поглощающее в УФ пятно окрашивается нингидрином, вещество окисляется периодатом натрия до соответствующего диальдегида (ссис-гликольная 25 группировка) и при гидролизе 1 н. соляная кислота, 100 С, 10 мин) дает только аденозин-фосфат и а-амина-(у-метилтио)-пропилфосфоновую кислоту (наличие ангидридной связи).30 Исследовалось влияние а-амина-у-(метилтио)-пропилфосфонил-аденилата на реакции, катализируемые валилфенилалашсл- и метионил-тРНК - синтетазами из 35 Е, со 1 В. В ходе этих реакций основными промежуточными соединениями являются соотв:тственно валил-, фенилаланил-, метио ннл-аденилаты. Фосфонатным аналогом последнего из ннх является целевой продукт, что подразумевало специфическое торможение только метионинового фермента. Результаты представлены в таблице. 45Ингибирование аминоацил-тРНК-синтетаз а-амино-у-(метилтио)-пропилфосфои ил-аденилатом Как видно из данных таблицы а-аминоу- (метилтио) - пропилфосфонил-адени - лат дейсгвует в случае метионил-тРНК синтетазы на 3 - 4 порядка лучше, чем по отношению к другим ферментам.П р и м е р 2, Ингибирование метионил- тРНК-синтетазы натриевой солью а-амино- -(метилтио) - пропилфосфонил - 5 - аденнлата,Метионил-тРНК-синтстазу Е. со 11 В получают, а метпониновую тРНК из суммарной тРНК Е, со В очищают известными методами. При определении активности фермента использовали ЛТФ-Ха соль, восстановленный глус атион С"-1.-метионин (56 Кссслсоль) Р"-пирофосфат натрия (10 Ксс(лсоль), активированный уголь Мог 1 А трис. НС и 3-меркаптомтанол и остальные вещества коммерческой чистоты без предварительной очистки.Ингибирование реакций аминоацилиро. вания тРНК и АТФ - ФФ обмена проводят в стандартных условиях при 37 - 37,5 С в течение 15 ясин. 50 мкл 9 1 О-з - 9 10-зМ раствора а-амино-у- (метилтио) -пропилфосфонил-аденилата вносят в инкубационную пробу непосредственно перед добавлением фермента. Инкубационная смесь содержит в пересчете на 0,5 мл: 60 лскмогь трас. НС (рН 7,4), 5 мкмоль хлористого магния, 5 мкмоль хлористого калия, 1 мкмоль восстановленного глутатиона, 1 мкмоль АТФ, 10 нлсоль Сс-метионина, 0,2 лсг тРНК и 0,007 мг фермента, Выход С 4-метионил-тРНК определяют по известному методу.Скорость АТФ - ФФ, обмена определяют в реакционной смеси, содержащей в 1 мл: 100 мкмоль трис НС (рН 8,0), 5 мкмоль хлористого магния, 100 мкмоль фтористого калия, 10 мкмоль 3-меркаптомтанола, 2 мкмоль ЛТФ, 2 зскссоль Р"-пирофосфата натрия, 0,015 мк фермента. Пробы анализируют ссзвестным методом, Константа ингибирования метионил-тРНК синтетазы в реакции АТФ - ФФ; обмена равна К; (М) 9 10 т, в реакции аминоацилирования тРНК К, (М 1 5 10671290 Формула изобретения Составитель Л. Никулина Тскрсд В. СеряковаКорректор С. Файн Редактор Е. Месропова Заказ 236/337 Изд. М 228 Тираж 497 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Тнп. Харьк. Фил. пред. Патент 1. Натриевая соль 1 а-амино- (метилтио) -пропилфосфонил-аденилата формулы:тнЯО Ов и т, 1, Сд - " - Он: - бн - он-г - о -.Р - о - .".:;л;."124 Н т ОЮа ОХд ,с 1 для избирательного ингибированпя ферментов биосинтеза белка в клетке,2. Способ получения соединения по п.1, отличающийся тем, что а-ампноу- (метилтио) -пропилфосфоновую кислоту конденсируют с аденозин-фосфатом в присутствии Х,Х-дициклогексилкарбодицмида в водном пиридпне, содержащем соляную кислоту.