Способ получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов

(19) 12 й 11/О ОПИСАНК ОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 81 1(56) Иммобилиэованные ферменты. Под ред.И.В.Березина, К.Мартинек. М,: МГУ, 1976;КИйааа М.К., Зодщга М., Тодоба НАйеа Арргоасп то Епгупи 1 пипоЬаатоп иКегат 1 пе Ое. НИсаИ КадаМ, 1978. 24(2), 103108,Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению гранулированных. нерастворимых форм иммобилизованных ферментов (биокатализаторов) на основе природного био- . полимера-кератина, которые могут найти широкое применение в биотехнологии, медицине и биологии.Известен способ получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов их реакцией по ЯН-связям с раствором восстановленного меркаптоэтанолом кератина с последующим диспергированием с образованием хлопьевидного . продукта.Недостатком известного способа является низкая механическая прочностьиммобилизованного продукта, что затрудняет его практическое использование.Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов высаждением ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМИ ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ(57) Использование: биотехнология, медицина, способы иммобилизации ферментов,. Сущность изобретения: раствор восстановленного кератина и фермента высаждают диспергированием .в смесь вода:этанол:сульфат аммония: 6,0:1,5 - 2,0:1,0 - 1,1. Гранулы промывают водой и обрабатывают смесью вода:сульфат аммония:формальдегид 30,0:5,0:1,0 - 3,0 в течение 3 - 4 ч при рН 7.0 - 7,5. 1 табл,восстановленного по ЯН-связям кератина и Я фермента из водного раствора путем сушки при комнатной темпрратуре с последующей обработкой полученных пленок глубаровым ф альдегидом при комнатной температуре и рН 8 - 9 в течение 5 - 6 ч.. (,)Недостатками данного способа являют- С) ся невозможность получения продукта в виде гранул, что обуславливает плохие гидродинамические свойства и затрудняет его применение в колоночных сорбционных процессах, а также крайне низкая механическая прочность полученных пленок, которую невозможно определить известными э методами.Цель изобретения -улучшение гидродинамических свойств биокатализатора.Поставленная цель достйгается тем, что раствор восстановленного кератина и фермента высаждают при диспергировании в смесь, состоящую иэ воды, этанола и сульфата аммония, взятых в массовом соотношении 6,0:1,5-2,0:1,0-1,1 соответственно, идальнейшую обработку проводят альдегидсодержащим соединением при рН 7,0 - 7,5 втечение 3 - 4 ч, а в качестве альдегидсодержащего соединения используют смесь вода:сульфат аммония:формэльдегид вмассовом соотношении 30.0:5.0:1,0 - 3.0 соответственно.Это позволяет получать нерастворимыеформы иммобилизованных ферментов сулучшенными гидродинамическими свойствами за счет получения продукта в видегранул правильной сферической формы свысокой механической прочностью (разрушающее напряжение 0,126-0,136 кг). Этодает воэможность эффективно использовать биокатализаторы в колоночных сорбционных процессах.Одновременно решается задача утилизации крупнотоннажных отходов птицеперерабатывающей промышленности, так какисходным сырьем для получения раствороввосстанновпенного кератина по стандартному способу являются сырье перопуховое(ОСТ 10-02-01-06-87), запасы которого являются возобновляемыми и практически неограниченными, утилизация которыхпредставляет собой серьезную народнохо, зяйственную проблему.Использование при высаждении диспергированием смеси вода:этанол:сульфатаммония, содержащей нэ 6,0 ч. воды менее1,5 ч, этанола и менее 1,0 ч. сульфата аммония, а также более 2,0 ч, этанола и 1,1 ч,сульфата аммония, не позволяет получитьгранулы правильной сферической формы иведет к образованию агрегатов денатурированного белка неправильной формы,Использование для обработки смесивода:сульфат аммония:формальдегид, содержащий менее 5,0 ч. сульфата аммония именее 1,0 ч, формальдегида, не позволяетдостичь высокой механической прочностигранул, а увеличение содержания сульфатааммония более 5,0 ч. и формальдегидэ более 3,0 ч. приводит к снижению активностииммобилизован ного фермента,Проведение реакции при рН ниже 7,0, атакже выше 7,5 не позволяет получить гранулы с высокой механической прочностью,При обработке гранул реакционнойсмесью менее 3 ч не достигается высокаямеханическая прочность продукта, Времяобработки более 4 ч, нецелесообразно, таккак не приводит к существенному улучшению свойств конечного продукта,П р и м е р 1. К 25 мл раствора восстановленного кератина добавляют при перемешивании 3,69 мл 2 У раствораПроводят высаждение белка при диспергировании в 100 г высадительной смеси, содержащей воду, этэнол и сульфат аммония в массовом соотношении 6,0;1,5:1,0 соответственно, Образовавшиеся гранулы промывают водой и обрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду,сульфат аммония и формэльдегид при массовом соотношении компонентов 30,0:5,0:1,0 соответственно, при рН 7,0 в течение 3 ч, затем промывают. водой. Диа 10 метр гранул 2,0 мм; лактатдегидрогеназа сохраняет 88,5 О исходной активности. Характеристики процесса и полученного продукта представлены в таблице. П р и м е р 2. Смешение компонентов и высаждение белка при диспергировании проводят аналогично примеру 1, Образовавш иеся гранул ы обрабатывают 1 00 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом со 20 отношении компонентов 30,0:5,0;1,0 соответственно, при рН 7,0 в течение 4 ч, затем промывают водой. Диаметр гранул 1,8 мм, Лактатдегидрогеназа сохраняет 82,3% исходной активности,П р и м е р 3. Получение продукта и его обработку реакционной смесью ведут аналогично примерам 1 и 2, но при рН 7,5 Диаметр гранул 1,82 мм. Лактатдегидроге 30 наза сохраняет 84 О исходной активности.П р и м е р 4. К 25 мл раствора восстановленного кератина добавляют при передиспергировании в 100 г высадительной смеси, содержащей воду, этанол и сульфат аммония в массовом соотношении компонентов 6,0:1,5:1,0 соответственно. Гранулы промывают водой и обрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом 40 соотношении компонентов 30,0:5.0:3,0 со- .ответственно, при рН 7,2 в течение 3 ч, затем промывают водой. Диаметр гранул 1,68 мм, Уреаза сохраняет 62,5% исходной активности.П р и м е р 5, К 25 мл раствора восста-. новленного кератина добавляют при пере 45 50 мешивании 0,01 г уреазы с активностью 724 ФЕ/мг. Проводят высаждение белка при диспергировании в 100 г высадительной смеси, содержащей воду, этанол и сульфат аммония при массовом соотношении компонентов 6,0:2;0:1,1 соответственно, Гранулы промывают водой и обрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом соотношении компонентов 30,0:0,2:2,0 соответственно, при рН 7,0 в мешивании 0,01 г уреазы с активностью 72435 ФЕ/мг, Проводят высаждение белка притечение 3,5 ч, затем промывают водой. Уреаза сохраняет 64,0 оисходной активности.Диаметр гранул 1,70 мм,П р и м е р 6. Получение гранул проводятаналогично примеру 5. Гранулы обрабатывают реакционной смесью, содержащей воду, сульфата аммония и формальдегид примассовом сботношении компонентов30,0:5,0;3,0 соответственно, при, рН 7,5 втечение 4 ч. 10Диаметр гранул 1,60 мм. Уреаза сохраняет 60,2% исходной активности.Пр и м е р 7. К 25 мл раствора восстановленного кератина концентрацией 12,5при перемешивании добавляют 0,1 г ферментного препарата глюкозоизомеразы изЯтг. гоЫ 9 поцзоз "Суоп 1 еп СоМерп" (Фин- .ляндия), активностью 2820 ед/г. Проводятвысаждение при диспергировэнии в 100 гвысадительной смеси, содержащей воду, 20зтанол и сульфат аммония в массовом. соотношении 6,0:1,5:1,0 соответственно, Обра.зовавшиеся гранулы промывают водой иобрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом соотношениикомпонентов 30,0:5,0:1 0 соответственно,при рН 7,0 втечение 3,0 ч, затем промываютводой. Диаметр гранул 2,0 мм, глюкозоизомераза сохраняет 72 оактивности, разрушающее напряжение 0,126 кг.П р и м е р 8, К 25 мл раствора восстановленного керэтина концентрацией 12,0 при перемешивании добавляют 0,01 г глюкозооксидазы активностью 118,700 ед. Далее процесс идет по примеру 7,.Диаметр гранул 2,0 мм,. глюкозооксидаза сохраняет 64 активности, разрушающее напряжение 0.26 кг.П р и м е р ы 9 - 12 (сравнительные). 40Процессы проводят аналогично примеру 1,соотношение компонентов высадительнойи реакционной смеси, технологический режим процесса и свойства продуктов пред-.ставлены в таблице, 45 Как видно из данных таблицы, предлагаемый способ позволяет получать биокатализаторы с улучшенными по сравнению с известными способами гидродинамическими свойствами за счет получения конечного продукта в виде гранул правильной сферической формы с высокой механической прочностью разрушающее напряжение 0,126 - 0,136 кг),Биокатализаторы, полученные по предлагаемому способу, в колоночныхсорбционных режимах позволяют значительно повысить удельную нагрузку на препарат (более чем в 3 раза по сравнению с известными способами), что в свою очередь прямо пропорционально продуктивности биокатализатора, Предлагаемый способ позволяет сохранять высокую активность иммобилизованного фермента. Способ является технологичным, продукт может выпускаться на серийном оборудовании. Предлагаемый способ дает возможность технологически просто утилизировать отходы птицеперерэбатывающей промышленности,Формула изобретения Способ получения биокатализаторов нэ основе иммобилизованных ферментов путем высаждения смеси восстановленного кератина и фермента из водного раствора с последующей обработкой альдегидсодержащим соединением при комнатной температуре,отличаю щийаятем,что,сцелью улучшения гидродинамических свойств биокатализаторов, высаждение осуществляют диспергированием в смесь, состоящую из воды. зтанола и сульфата аммония при массовом соотношении 6,0;1,5 - 2:1,0-1,1 соответственно, обработку альдегидсодержащим соединением проводят при рН 7;0 - 7,5 в течение 3-4 ч, а в качестве альдегидсодержащего соединения используют смесь вода:сульфат аммония:формальдегид в массовом соотношении 30,0:5,0:1,0-3,0 соответственно,1730147 Технологический ремни процесса и свойства продуктовак.Ссотнопение соотновение , рПкоипонеытов ре-Сохранение днанетр активности полученФерненте, ных гра" В нул, ии Прниер Фориарит,тивность,коипонентое ФВ/иг 30,0:5,0 с 1,0 2,0 0,126 5,9 3% 7,0 3 88,5 6,0; 51,0 То ме 3 472 73 3 Глюкозоизоь иераза 2,82 6,93 ГЛГ 6,0:1,51,0 30,0:5,01,0 2,0 , 0,126 3 Глюкозооксн"дава 118,7 2,0 0,126 64 7,0 6,0:1,5;1,0 30,0;50:1,0 85,2 Лахтатдегилрогеназа Продуктнеправильной Фориы 6,0 6,0:1,0:0,5 30,0:5,0;1,0 6,0:3,0:25 30:5,0:1,О 84,3 Продукт фнеправильной Фориы 1 О То же 34,2 Гранул .т6,0;1,5;1,о 30,9:3,0:0,5 83,3 2,15 0,051 Лактатдегндрогеназа 2,34 Уреаза 751 ф В числителе указана величина после 5 ч испытаний в значенателе - после Т 20 ч. Составитель Ю,КульчицкийРедактор М.петрова Техред М.Моргентал Корректор ВГирняк Заказ 1489 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 12прототипп Лактадегидрогеназа200 высадительнойсмеси водазтанолсульФат аммония 6,0:1,5:1,0 6,0:1,5,1,0 6,0: 5:1,0 акц. снеси вода:сульфат аниониятФориальдегид 30,0:5,01,0 30,0:50:1,0 300:5030 7,4 7,5 7,2 Вреияобработки,