Способ определения активности -лизин -оксидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН у 5 у) С 12 й 1/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЮ(56) 1, Сяткин С.П.,Галаев Ю.В. Окисление путресцина, спермидина и спермина диаминооксидазой печени мыи, -"Биохимия", 1977, т, 42, вып.б,с. 1010-1013,2, Кцаа 1 аЬе Н., Кодоща К.,КцппоХа А 3 ояЬ 1 по Н Боба К.ЕхС гасе 11 ц 1 ог ргобцсСоп Ь уе 1 п А-охудаае 1 п СЬе чЬеоС Ьгоп сц 1 Сцгеба аСга 1 п оГ ТгсЬодегва чг 1 бе.- ииАкг 1 сц 1 Сцго 1 Н 1 о 1 о 81 са 1 СЬеш 1 аСгу1980, г. 44, 9 2, р. 387-392.(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ (,-ЛИЗИН-сс-ОКСИДАЗЫ в культурегриба рода Тг 1 сЬобегва, включающийкультивирование гриба на пшеничных ЯО 1047957 А,отрубях, центрифугирование водного экстрата культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащей (,-лизин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и удешевления способа, определение активности фермента проводят по 0,04-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят 0,04-ную пероксидаэу, 0,5-ный 0-диайиэидгидрохлорид и 0,05 М трис -НС 1 в качестве буферной системы, а -.лизин используют в концентрацйи 5 мкМ при следующем соотношении компонентов, об. 0,05 М трис-НС 1 15-30Ф 5 мкМ (. -лизин 50-55 0,04-ная перок 4 идаэа 4-5 0,5-ный 0 -ди- аниэидингидрохлорид 4-5 Водный экстракт культуры 12-20Изобретение относится к бЪрхимии,конкретнее к биохимическим способамопределения активности ферментов,в частности , -лизин-Ы-оксидазы иможет быть применено в мигробиологии, биохимии, медицине, ферментной 5медицинской промышленности, дляопределения активности 1,-лизин-о-оксидазы, которая ингибирует рост лейкемических клеток мыши п чСго цдп чьего, 10Известен спектрофотометрическийспособ определения активности другойоксидазы - диаминооксидаэы. Способоснован на взаимодействии образующейся при ферментативной реакции Н О 25с 0 -дианизидингидрохлоридом в присуствии пероксидазы. Способ былиспользован для определения активности диаминооксидаэы в тканях животных,1 3.Недостатком способа. является необ ходимость 20-минутной прединкубациипроб для определения активности.Кроме того, способ применяется только для определения активности диаминооксидазы в экстрактах тканях животных,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности являетсяспособ определения активности 1,-лизин-с-оксидазы в культуре гриба рода Тг 1 спойегиа,включающий культивирование гриба на пшеничных отрубях,центрифугирование водного экстрактакультуры и определение активности вреакционной смеси, содержащие Ь-лизин,водный экстракт культуры и буфернуюсмесь с рН 8,0.Определение проводят следующим образом, Реакционная смесь содер жит -лизин и Фосфоркислый калийрН 8,0 ) в конечных концентрацияхсоответственно 10 и 70 мкМ, а также350 ед. каталаэы из печени быка и разные количества водного экстракта культуры гриба. Смесь инкубируют аэробно при 37 С 20 мин со встряхиванием. Реакция заканчивается добавлением 0,1 мл 25-ного ТХУ и проба центрифугируется. После центрифугирования 1 мл чистого супернатанта смешивается с 2 кп 1 М ацетатного буФера рН 5,0 и 0,8 мл 0,1-ного 3-метил-бенэотиазолинонгидроэон-гидрохлоридом свещеприготовленным. Инкубация проведена при 50 С 30 мин. Затем реакционная смесь охлаждается до комнатной температуры, поглощение измеряется против контроля при максимуме поглощения (316-325 нм) на спектрофотометре. белок определя ют по Лоури и эа одну единицу активности фермента принято количество фермента, каталиэирующего образование 1 мкМ о 1 -кетоаминокапроновой кислоты за 1 мин, 2 ., , 65 Недостатком известного способаявляется использование редких и доро.гостоящих реактивов: каталазы из бычьей йечени, с-кетоаминокапроновой кислоты, 3-метил-бенэотиаэолинон-гидраэонгидрохлорида, а такжемногостадийность определения.Цель изобретения - ускорение иудешевление способа определенияактивности 1,-лизин-с-оксидаэы,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения активности ,-лиэий-К-оксидаэыв культуре гриба, рода Тг 1 сЬойегюа,включающему культивирование грибана пшеничных отрубях, центрифугирование водного экстракта культуры иопределение активности в реакционнойсмеси, содержащей 1,-лизин, водныйэкстракт культуры и буферную смесьс рН 8,0, определение активностифермента проводят по 0,04-ной перекиси водорода, в состав реакционнойсмеси вводят 0,04-ную пероксидаэу.0,5-ный О -дианиэидгидрохлорид и0,05 М трис-НС 1 в качестве буФернойсистемы, а 1,-лизин используют вконцентрации 5 мкМ при следующем соотношении компонентов, об.:,О, 05 М тРис -НС 1 15-305 мкМ , -лизин 50" 55О, 04-ная пероксидаза 4-50,5"ный О-дианизидингидрохлорид 4-5Водный экстракт культуры 12-20Способ заключается в том, чтофермент ,-лизин-о-оксидазу получаютпутем культивирования штамма Тг 1 спойегща зр,в 250 мл колбе с 10 г пшеничных отрубей с 7 мл 11,4-ногоИаБО, 1.0 мл Н О при 28 С 14 дней,Затем в колбу добавляют 100 ил Н 20,в течение 2 ч культуру встряхиваютпа Яс 1;цССе 1 аппагаС Сур,е 327 ("Ргешй"ПНР. и отжимают через хлопчато бумажную ткань, а водный экстрактцентрифугируют от спор и мицелия и определяют активность А-лизин-А-оксидаэы.1 еакционная смесь содержит,об.на 1 мл:О, 05 М трис-НО 1 15-305 мкМ 1-лизин 50-550,04-ная пероксидаэа 4-5О, 5-ный О -дианиэидингидрохлорид 4-5Водный экстракт культуры 12-20Смесь инкубируют аэробно прио.37 С 20 мин и охлаждают, Реакциюэаканчивают добавлением 1 мл 98 н.НС 1 и послЕдующим охлаждением пробы до комнатной температуры.Оптическую плотность окрашенныхрастворов измеряют на спектрофотометре при 540 нм.1047957 Составитель, В.МуронецТехред В.Далекорей Корректор ВГирняк Редактор Т,Веселова Заказ 7864/28 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филйал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 Нижняя граница чувствительностиметода + 0,1 нмоль, воспроизводи-.мость т 0,1 нмоль. Белок определяют по Лоури. За 1 ед. активности Фермента принято 5 количество фермента, каталиэирующего образование 1 нмоль Н 20 за 1 мин в стандартных условиях.,П р и м е р 1, Инкубационная 1 О смесь имеет следующий состав,: 5 мкМ . -лизин 55 Ф,05 М трис -НС 1 бу,фер, рН 8, О, 15О, 04-ная перокси- даза 5; 0,5-ный О -дйаниэидингидрохлорид 5; водный экстракт 20 Смесь инкубировали аэробно при 37 С 20 минут и охлаждали. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н. НС 1 и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенного раствораЯ измеряют спекгрофотометрически при 540 нм. Активность фермента в ообе 2,3 ед. 11,5 ед/мл экстракта). П р и и е р 2. Инкубационнаясмесь имеет следующий состав,:5 мкМ .-лизин 50,трио -буфер,рН 8,0, 30; 0,04-ная.пероксндаза 4; 0,5-ный О -дианизингидрохлорид 4, водный экстракт 12, Смесьинкубируют аэробно при 37 С 20 мини охлаждают. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н. НС 1 и последу"кщим охлаждением пробы до комнатнойтемпературы, Оптическую плотностьокрашенного раствора измеряют спектрофотометрически при 540 нм. Активность фермента в пробе 1,3 ед.(11,67 ед/мл экстракта ),Предложенный способ исключает использование дорогостоящих реактивовкаталазы из печени быка и 3;метил-бензотиазолинон- гидраэонгидрохлорида , кроме того, существенно сокра-щает определение активности ,-лизин-с-оксидазы ( на 30 мин ) за счет отсутствия второй стадии - реакции с3-метил-бенэотиазолинон-гидразон"гидрохлорндом.