Способ получения биомассы, обогащенной полинуклеотидфосфорилазой

ц 661006 Союз СоветскинСоциалистическимиРеотубпик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет -Опубликовано 05.05.79. Б Государственный комете СССР по делам нэаоретеннй и открытнй(53) УДК 577. .15 (088.8) та опубликования описания 25.05,79,(72) Авторы изобретен иестуре и М. Р. Витенб А. Шмите, Д авите 71) Заявите 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ, ОБОГАЩЕНН ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗОЙИзооретение относится к способу получения микробильных биомасс, обогащенных биологицески активными веществами.Известны методы полуцения биомасс с полинуклеотилфосфорилазцой активностьк из родов А 7 о 1 оЬас 1 ег, М 1 сгососсцз, Рзецдогпопаз, АегоЬас 1 ег, Рго 1 ецз, Вас 111 цз, Яегга 11 а, Хап 1 Ьогпопаз, АсЬгогпоЬдстег, ЕзсЬег- с Ьа.Известен способ получения оиомасс цз ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 1 с полинуклеотилфосфорилдзной активностью, предусматривающий использование ЕзсЬег 1 сЬа со 1 с активностьюел/мг белка 1.Наиболее близким по техницеской сугцности и достигаемому результату является спосоо полуцеция биомассы, обогащенной полин клеотилфосфорилазой, предусматривающий культивирование бактерий ЕзсЬег 1- сЬ 1 а со 1 цд питательной среле, солержащей псцтоц 2 О/о, глюкозу 0,20/о, КНе РО -- 0,1 гпМ МагНРО 4 - 0,1 гпМ (.Н)2 ЯО, - 0,2%, Чд 50.; -- 0,01 О, ГеО,5 мг,л. Условия культивирования:рН питательной среды -- 7 4, температура 3 Результаты культивирования:выход биомассы (по сухому весу) - Зг/л, дктццость фермента - 0,88 р МР/мг белка 2.Нс,нстаткдми известного процесса являстся недостаточно высокий выход биомассы, тдк кдк не обеспечивается в полной мере питание органическим азотом, и недостаточно высокая активность полинуклеотидфосфорцлдзы в биомассе; что обусловлецо низкой цролуктивцостью штамма и тем, что питательная среда не обеспечивает достаточного углеводного питания, не обладает стабилизированной буферной системой и содержит поц аммония, который подавляет накопление фермента в биомассе.Целью цреллдгдемого изобретения является увеличение выхода биомассы с повышенной цолинуклеотцлфосфорилазной активностью.Поставленная пель достигается тем, цто из штдммов ЕзсЬсг 1 сЬа со 1 используют штамм МКЕ - 600, д в состав питательной среды лоцолццтельцо вволят лимонную кислоту, гцлролиздт кдзеццд и дрожжевой зкстрдкт, црц атом;люкозу, цептон и фосфа 661006ты бсрут в соотношении 1:0,02:1,66, а количество лимонной кислоты устанавливаютравным 0.025% от обьегга среды.Предлагаемое техническое решение обеспечивает увеличение выхода биомассы, обогащеной иолицуклеотидфосфорилазой до4,5 - 5 г/л, и повыцение активности фермента до 20 - 25 ед/мг белка.Ис(пог званный в качестве иродуцецташтамм Е. со 1 МКЕявляется мутантом,не способным синтезировать РНК-азу 1 и10обладает повышеой способностью синтезировать ПНФ-азу.Штамм Евсгег 1 сгз со 11 МКЕполучениз коллекции музейных культур Гос. контрольцого института им. А. А. Тарасевичав 1972 г.и имеет следующую характеристику.Морфология: палочки с размерами 11,5 -2,5) Х (0,3 - 0,6) г, грамотрицательцы, споры е ОбоазуОт, иодвжь. Физиолого-биохимические Свойства: факультативный ацяэроб, желатииу не разжижает, культура растет ця сицтстических средах, иреимуществен Оцо исггогьзуОт аммиачиый азот, гякже растет иа средах с пеитоиом, дрожжевым явтолизятом, гидролизатом казеиля, свободный азот це фиксирует.ОтОИ(ние к источггикз( углеода: сбра 25ж и я (.т м О и О -, д и - и и О 1 и с 3 х 3 р и д ы, с Г и р т ы иОгациси( кислогы. И иос.сд;их с,збоиспользует ( умяро.ю и з 1:Окамсцную кис.оту, ие исиогь.уег,гмонгую и яблочн) юкислоты.В процессе роста игамм образует аммиак, ссгогОц(р(.1, и(дол, восстанавливает нитргТьг( игггито 1,Култура растет ири рН о 9, оптимумр 11 р(ста 6 - (, г емиература роста 30 - 37 С,имеет дезамиицрукигие и дскярбоксилирук- щие способности.Наряду с исцользовацием нового штамма согласно предлагаемому изобретению всостав гг(тзтс:ьно 1)ед. вв(х 1 ят лимоннуюкислоту как ицдуктор иолицуклеотидфосфорилазы и стабилизатор буферной системы.Присутствие лимонной кислоты в питательной среде влияет ца реакции цикла трикарбоновых кислот клетки, таким образомсдвигая окислвельньге процессы клетки, косвенно вызывая усиление биосинтеза ПНФазы. 45Лимонная кислота в питательной средеповышает растворимость солей магния и солей других двухвалецтных металлов и темсамым стабилизирует фосфатно-буфернуюсистему питательной среды, препятствуя образованию нерастворимых фосфатов и выпадению их в осадок. Таким образом, ионымагния и фосфатов становятся более доступными для питания клеток, что способствуетприросту биомассы.55Стабилизированная буферная система предотвращает преждевременное подкисление питательной среды во время роста культуры и обеспечивает повышеный выход биомассы.Введение в иитагельцую среду глюкозы,пептона и фосфатов в соотношении 1:0,02::1,66 оказывает значительное воздействиена дыхательную функцию, вызывая дисбаланс в синтезе макроэргических соединенийфосфора и си итеза Р Н К.Выращивание клеток ири низшей точкеоптимальных температурных пределов роста, т. е. при 28 - 30 С, также уменьшает дыхательную активность клеток.Снижение дыхательной активности вызывает повышение концентрации ортофосфатовв клетке и дегарадацию РНК в ней, что способствует биосинтезу и накоплению полинуклеотидфосфорилазы.В питательную среду для обеспеченияразнообразия органического азота добавляют также гидролизат казеина и дрожжевой экстракт.Таким образом способ заключается в следующем: в качестве иродуцента ПНФ-азыиспользуют штамм Евсгегсг,а со 1 М 2 Е.Для получения биомассы, обо ащенной полицуклеотидфосфорилазой, культуру выращивают на синтетической питательной средеследующего состава:Пеитон 0,1%Идролизат казеина 1 - 2%Дрожжевой экстракт 01-02%КНг Р 04 25 - 30 гпММагНР 04 25 - 30 гпММдЮ 4 0 025%Лимонная кислота 0 025%Глюкозу в количестве 45/о вводят впитательную среду в виде стерильного раствора. Максимум биосицтеза иолинуклеотидфосфорилазы достигается к 6-ому час культивирования.Результаты культивирования.Выход биомассы 4,5 - 5,0 г/л,Активность ПНФ-азы 20 ед/мг белка.Г 1 осле ферментации биомассу отделяютсепарацией и замораживают. В таком видеПНФ-азная активность сохраняется до 6 месяцев без потерь.Пример 1.В качестве продуцента ПНФ-азы используют культуру Е. со 11 МКЕ.Питательная среда содержит:Пептон 0 о/оГидролизат казеина 1%Дрожжевой экстракт 0,1%КНг Р 04 30 гпММаг НР 04 30 гпММд 04 0 025%Лимонную кислоту 0,025%1% глюкозы вводят в питательную среду в виде стерильного раствора в начале ферментации, остальные 4% - к 4-му час ферментации, рН питательной среды поддерживают на уровне 7,5 - 7,6 при помощи 50%-ного раствора КОН.661006 Формула изобретена Составитель И. ПриваловаТекред О. Луговая Корректор Е. Папи Тираж 525 Подписное Редактор И. ГрязноваЗаказ 2389/24 ЦН И И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5 филиал ППП аПатентэ, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Выращивание микробной биомассы Е. со МКЕ. Культура Е. со 11 МКЕподдерживается на столбиках МГ 1 А под вазелиновым маслом, пересевается 1 раз в год.1. Выращивание посевного материала. Культуру пересевают на косяки и вырашива ют 24 час, после чего культуру пересевают в колбу со 100 мл питательнои среды, инкубируют стационарно 10 в 12 час. Инокулят готовят, пересевая 10 - 12 час культуру на 800 мл свежей среды из расчета 1:10 и вырашивают на качалке при 37 С, 100 об/мин 3 час. 2. Ферментация культуры Е. со 1 МКЕпроизводится после добавления инокулята из расчета 40 мл культуры на л питательной среды. Ферментацию ведут при температуре 29 - 31 С в условиях принуди тельной аэрации (2 л воздуха/л питательной среды).Во время ферментации контролируют однородность культуры, прирост биомассы, рН. Выход биомассы - 4,5 г/л. Активность ПНФ-азы - 25 ед/мг белка.20Лример 2.Состав питательной среды:Пептон О,ГидРолизат казеина 2 о/оДрожжевой экстракт 0,2",о25КН РО, 25 п 1 М1 х 1 аг Н РО, 25 п 1 ММО, 0 25 о/оЛимонная кислота 0,25/оГлюкозу в виде стерильного раствора вводят по 1% через О, 1, 2, 3, 4 час культи вирования. Остальные операции осушествляют как в примере 1. Вымол биомассы - 5 г/лАк 1 ивность полинуклеотидфосфорилазы 20 ед,мг белка.Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает выход биомассы - 4,5 - 5 г/л и активность полинуклеотидфосфорилазы 2025 ед/мг белка. Способ получения биомассы, обогащенной пол и нуклеотидфосфорил азой, предусматриваюгций культивирование ЕвсЬепсЬа со на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сернокислый магний и фосфаты, тличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и интенсификации накопления полинуклеотндфосфорилазы, из штаммов Евс 11 егс 11 а со 1 используют штамм МКЕ, а в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, при этом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1: 0,02: 1,66.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лимонную кислоту вводят в количестве 0,025/о от объема питательной среды.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Мв 401667, кл. С 07 Н 22/03, 1973.2. 1. К. %111 агпв, М. бгцпЬегд - Мападо. Ро 11 пцсео 1 Ые рЬовр 11 опаве 11 ац 1 егпеп 1 рцгйс а раг 1 ц с 1 е Е. со 11. - В 1 осЬегп В 1 оЬу 5 Ас 1 а 1964, 89, р. 66.