Способ получения иммобилизованной кислой протеиназы

.801014882 А у С 12 В 11/08 ТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ГОСУД АРСПО ДЕЛ ИЗОБРЕТЕ ОПИ(71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им, М,В.Ломоносова и Всесоюзный научно"исследовательский институт Биотехника(56) 1, Мотина Л,И., Нахапетян Л.А., ффОптимизация условий иммобилизации кислой протеиназы из Азрегд 111 цз аыащог 1 ф,-фПрикладная биохимия и микробиология 1, 1979, т. 14, В 3, с, 410-413.2, Мотина Л.И., Борисова В.Н., Нахапетян Л,А ефИммобилизация кис-. лой протеиназы из Аврегд 111 ць аюащогх на неорганических носителях с карбоксильными группамиф,-Прикладная биохимия и микробиологияф, 1981, т. 16, Р 2, с. 212-218.(54),(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о т" л и ч,а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта, Ферментсодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакри" лозойкислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении Фермент: хлорангидридз (100-400), а связывание фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с.гидрофильным ненасыценным мономером в присутствии бифункционального сшивающего агента.2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в качестве ферментеодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П 10 Х или.его ультраконцентрат,3 Способ по пп. 1 и 2, о т л и " Е ч а ю щ и й с я тем, что в качестве гидрофильного мономера используют акриламид или метакриламид или Н-винилпироллидон, а в качестве сшивающего агента иСпользуют В,Н-метиленбисакри. ламид или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля со степенью полиеризации 3 или 13.4. Способ по пп. 1-3, о т л и - ч а ю щ.и й с я. тем, чтд полимеризацию проводят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной сме. си 2,5-20 вес.Ъ, а бифункционального сшивающего агента; 0,1-17 вес,Ъ.Вм К АВТОРСКОМУ С сИзобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способу получения препаратов иммоби" лизованной на синтетических полимерах кислой протеиназы, которая широкоприменяется в пищевой промышленностии медицине, Изобретение может бытьиспользовано для получения высокоак"тивных стабильных препаратов иммобилизованных кислых протеиааз,Кислая протеиназа (КП) продуцируется микроскопическими грибами видаАврегд 111 цз при их поверхностнойкультивации, Существует несколько видов этого гриба, способных продуцировать различные типы протеиназ. Наибольший интерес с точки зрения гидролиза высокомолекулярных белков пред"ставляет КП, выделяемая из Азрегд 11 -1 цв ГоеМЙиз Препарат, получаемыйна основе этого продуцента, наэывае Омый пектофоетидином П 10 Х, содержитсмесь ферментов, в том числе и КП,Эта протеиназа стабильна в областирН 2,5-б,0 и успешно применяется дляпрепаративного гидролиза высокомолекулярных белков, присутствующих в некоторйх кислых пищевых напитках и отрицательно сказывающихся на их качестве.КП из пектофоетидина П 10 Х имеетмолекулярную массу около 40000, инги-З 0бируется Н,4-динитрофвнил-И-диазо"ацетилэтилендиамином и пепстатином,а ее активность при 20 С (рН 2,5-б,0)сохраняется лишь в течение 24 ч, после чего укаэанная КП полностью инак" 35тивируется,Использование КП для .гидролиэа высокомолекулярных белков в силу указанных свойств связано с рядом труд"ностей, обусловленных низкой стабиль ностью препаратов, приводящей к существенной потере активности КП припроведении гидролиза белков в течение 2-3 ч. Эти трудности могут бытьпреодолены использованием препаратов 45иммобилизованного Фермента.Известен способ получения иммобилизованной кислой протеинаэы путемковалентного связывания фермента сводонерастворимым носителем, заключаюцийся в том, что модифицированноеаминопропилтриэтоксисиланом неоргаическое стекло, выступаюцее в роливодонерастворимого носителя, обрабатывают глутаровым алвдвгидом, а затем раствором фермента 1,55 Недостатком способа являются низкая ферментативная активность препаратов иммобилизованного Фермента (она составляет 23-24 от исходной), 60 а также низкая устойчивость препаратов при хранении за счет гидролиза аэометиновых связей, посредством,которых проводится ковалентное связывание фермента с носителем, 65 Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому результату кпредлагаемому является способ получения иммобилизованной кислой протеиназы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, который заключается в обработке нерастворимогостекла у -аминопропилтризтоксисиланом(введение на поверхность стекла первичных реакционноспособных аминогрупп)в ацетоне, последующей обработке модифицированного носителя янтарным ангидридом в диметилформамиде (введениекарбоксильных групп) и последующемактивировании карбоксильных групп носителя водорастворимыми карбодиимидами и обработке активированного носителя раствором фермента при 4 С в течение 12 ч 2) .Недостатком способа является низкая ферментативная активность иммобилизованного фермента,. составляющая23-51% от исходной,Цель изобретения - повышение ферментативной активностиПоставленная цель достигается тем,что в способе Получения иммобилизованной кислой протеиназы, заключаюцемся в связывании Фермента с носителем, ферментосодержащий растворпредварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-ь,5и мольном соотношении фермент: хлорангидрид - 1 г(100-400) и связываниеФермента с носителем осуществляютсовместной полимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным ненасыщенным мономером в присутствии биФункционального сшивателя,Обычно в качестве ферментсодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П 10 Х или его ультраконцентрат,в качестве гидрофильного мономераобычно используют акриламид или иетакриламид или И-винилпироллидон, вкачестве сшивающего агента Б,М-метиленбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13,При этом полимеризацию обычно про-водят при концентрации гидрофильногомономера в реакционной смеси 2,520 вес, Ъ, а бифункционального.сшивающего агента 0,1-1 вес,З,Способ позволяет получать иммобилизованный ферментный препарат на основе кислой протеиназы с активностью 93-99Предлагаемый способ осуществляютследующим образом,Соответствующее количество пектоФоетидина П 10 Х, имеюцего определенную активность, которая выражаетсяв единицах активности, растворяют в100 вес,ч, воды, добавляют необходимое количество хлорангидрида, пере45П р и м е р 8, Все операции выполняют так же, используя вместо раство 50 мешивают в течение 15-20 мин затем в эту же смесь вносят гидрофильный мономер, бифункциональный мономерсшиватель, инициатор радикальной полимеризации (персульфат аммония) и продувают аргоном в течение 20- 30 мин. После этого добавляют катали затор полимеризации (М, В, И, И-тетраметилэтилендиамин) и полимеризуют 1 ч. После окончания полимеризации получившийся гель измельчают на.нейлоновых ситах, промывают водой и водноспиртовой смесью и оставляют набухать в буФере, в котором предполагается проведение определения Ферментативной активности. Общее время получения геля 4-5 ч.Образующиеся продукты представляют собой сильно набухающие в воде гидрогели и используются для гидролиза белков либо путем инкубирования соответствующей навески геля с раствором белка, либо путем хроматографирования раствора белка через колонку, заполненную нерастворимым полимером с иммобилизованной КП.Поскольку исходное вещество представляет собой неочищенный продукт, то количество КП в нем крайне трудно установить. Препараты подобного типа характеризуют относительной активностью, выражаемой в единицах протеолитической активности, При этом за единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента в мг, которое вызывает прирост оптической плотности при 280 Нм на одну единицу (при определении активности соответствующим образом) за 1 мин. Поскольку истинное количество КП в пектофоетидине П 10 Х неизвестно, то активность ее определяется по единицам активности, Так 1 г пектофоетидина П 10 Х имеет активность 40 единиц. Протеолитическая активность при этом определяется по 2-ому раствору. гемоглобина в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,5) при 37 С, Степень связывания Фермента определяют по отношению активности получаемого препарата, промытого.до полного вымывания несвязанного белка, к активности исходного, выраженную в .Ацилирование хлорангидридами пектофоетидина П 10 Х в растворе, также как ацилирование его ультраконцентра 5 10 15 20 25 30 35 40 та, проводят при рН 2,5-4,5Болеевысокие значения рН приводят к инактивации фермента. В качестве гидрофильных мономеров используются широ"кораспространеннйе мономеры - акриламид, метакриламид, винилпироллидони пр, Сшивателями являются типичныебифункциональные мономеры: акрилатыи метакрилаты этиленгликоля или. еготепломеров и полимеров (эфиры ТГМ-З,ТГМи пр.), М,М"метиленбисакриламид и пр.Инициаторами радикальной полимеризации служат пераульфаты щелочных металлов с тетраметилэтилендиамином,рибофлавин, которые растворимы в воде и работают при комнатной температуре. Инициатором может служитьУф-облучение.П р и м е р 1, 20 г пектофоетиди"на П 10 Х растворяют в 100 мл воды охо/лаждают до 0 С и доводят до рН 2,5.К этому раствору по каплям добавляют2 г хлорангидрида акриловой кислотыи раствор перемешивают в течение 1520 мин, доводят до комнатной темпе"ратуры за этот промежуток времени,и в этот же раствор добавляют приперемешивании 5 г акриламида и 0,2 гметиленбисакриламида, В раствор вносят 0,003 г персульфата аммония, продувают аргоном в течение 20-30 мин,добавляют 0,003 г тетраметилэтилендиамина и оставляют на 1 ч, Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают водой и 5-нымводным этанолом из расчета 0,5 лраствора на 1 г геля, Протеолитическую активность определяют по 2-омураствору гемоглобина в качестве субстрата. Гемоглобин растворен в 005 2 Лацетатном буфере (рН 4,5) при 37 С.Активность через неделю и через месяц определяют аналогичным образом,храня препараты при 4 ОС,ра.пектофоетидина (10 г на 100 мл воды) ультраконцентрат пектофоетидина. П 10 Х в количестве 100 мл, Содержаниеактивного начала в препарате такжеравно активности 10 г пектофоетидина П 10 Х,Данные по примерам 1-7 приведеныв табл,ю о о о ф 0 4 фхМ х х Б п 3 а Х о о о л Ч а ол бэиибц г. боочивьен хо ькоэи т вабаь чхоонвихмуцонйохои хо ихоонвихмц В ЙХООНВИХМЭ Г(ИНИйэ дц имад чхоонвихме венбеииА;)-хх зва н(;в охи 1 (;( Х ива хааа 1 1 х й 1 ООд 1 ДЕХ 1 О(ОВ ЦС ххв ао( хо 1 ЮХ ц о рц о х йо 1 йЦХ ххх ахи ах( о ах ц (с в ханц 1 1 (1й 1 Х М,1014882 Составитель О.СкородумоваРедантор Е.Лушникова Техрбд С.Мигунова Корректор А.Дзятко Заказ 3132/21 Тираж 523ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Подписное Филиал ППП ффПатент, г,ужгород, ул.Проектная, 4 Таким образом, предлагаемый спо" соб позволяет получать высокоактивные препараты иммобилизованной кис" лой протеиназы. Получающиеся иммобилиэованные препараты стабильны в течение длительного времени (стабильность самой КП всего 24 ч), не требует специальной очистки фермента, поскольку предлагаемый способ иммобили-,зацни позволяет одновременно иммоби-. лизовать КП из сырца и сформировать матрицу водонерастворимого носителя, для чего не требуется очищать фермент по известным биохимическим способам.Способ можно использовать для очистки различных кислых пищевых растворов от высокомолекулярных белков,