Способ определения изоферментной активности гликогенфосфорилазы

(:НИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТМ АВТОРГНОМУ СВИДНВЪСТВУ ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ Сс ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ(71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТНОИ АКТИВНОСТИ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ путем электрофоретического разделения пробы на поддераивающей среде с проявлением в буфере и опреЯУ1 008655,4 делением .активности изоферментов спектрофотометрически, о т л и ч а - ю щ и й с я . тем, что, с целью сокращения времени определения изоФерментной активности, разделение ведут в трис-веронал-мединаловом .буфере на ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего .буфера используют фосфатный буфер, содержащий 292,0 - 292,5 10 3 М гликогена, 18- 20 - 10 Ъ аденин-фосфата натрия 64-671(ГЗМ глюко,6-дифосфата, 31"3310 ЗМ сульфата магнезии, 80 90 ед./л глюкозо-Фосфатдегидрогеназы. 40-50 ед/л Фосфоглюкомутазы, 6,4-6,610 М никотинамиддинуклеотидфосфата натрия и 31-33 1 цЗМ 1 о этилендиаминтетрауксусной кисло- тыеИзобретение относится к медицине и может быть использовано при биохимических исследованиях.Известен способ разделения изоферментов гликогенфосфорилазы методом диск-электрофореза в геле полиакриламида, согласно которому образец гомогеяата наносят на поверхность полиакриламидного геля, заполняющеговертикально расположенную стекляннуютрубку. Трубку помещают в злектрофо ретическую камеру и проводят электрофорез при напряжении 110-120 В силе тока 6-8 мА в течение двух часов. Затем полиакриламидный гель выдавливают из трубки и помещают в кювету для окрашивания, Для выявления изоферментов реакцию ведут в сторону синтеза гликогена из глюкозо-фосфата, с последующей окраской полисахарида раствором Люголя. После окрашивания яа прозрачном фоне геля видны коричневого цвета фракции, которые оценивают в проходящем свете. Благодаря хорошей разрешающей спо. - собности геля четко выявляется спектр изоферментов гликогенфосфорилазы 1). 25Недостатком способа является длительность его осуществления время проведения исследования составляет 24 ч и складывается из времени, затрачиваемого на полимеризацию геля, 30 электрофореза и проведение биохимической реакции, ведущей к образова:нию необходимого количества гликогена продолжающейся 17 и более часов). Изза этого ограничены возможности при- З 5 менения данного способа в медицине например, для диагностики инфаркта миокарда, и в эксперименте. Кроме того, осуществление способа ведет к значительным затратам реактивов, так 40 как приходится инкубировать большое количество полиакриламидного геля и использовать значительное количество инкубационной смеси для его погружения и пропитки.Цель изобретения - сокращение времени определения изоферментной активности.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения изоферментной активности глико генфосфорилаэы путем электрофорети" .ческого разделения пробы на поддерживающей среде с проявлением в буфере и определением активности изоферментов спектрофотометрически,разде ление ведут в трис-веронал-мединаловом буфере яа ацетатцеллюлозной пленке, а в качестве проявляющего буфера используют фосфатный буфер, содержащий 292,0-292,5 . 10 3 М гликогена, 18-20 10 Ъ аденин-фосфата натрия, 64-67 1(Г 6 М клюко,6-дифосфата, 31 33 1 ПЗМ сульфата магнезии, 80 - 90 ед/л глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, 40-50 ед./л фосфоглюкомутазы, . 6,4-6,61 КЗМ никотинамиддинуклеотид19,2 10 3 32,7 10 фосфата НАДФ) натрия и 31-33 103 Мэтилендиаминтетрауксусной кислоты.Образовавшийся в результате реакции никотияадениндинуклеотид проявляют в ультрафиолетовом свете.Способ осуществляют следующим образом.Образец гомогената наносят на ацетатцеллюлозную пленку, которую затем помещают в электрофоретическуюкамеру. Электрофорез проводят принапряжении 340-360 В и силе тока 911 мА в течение 10-12 мин, По окончании электрофореза пленку извлекаюти накладывают на другую пленку, пропитанную инкубирующим раствором,содержащим набор ферментов, НАДФи гликоген,необходимые для проведения реакции. Пленки .инкубируют при37 С в течение 20-25 мин. Указанноевремя инкубации является оптимальным,так как уменьшение времени инкубации приводит к недостаточной наработке НАДН+, а увеличение не улучшаетрезультаты. Затем пленку высушиваютпри той же температуре в течение 510 мин. Выявление фракций проводятпри ультрафиолетовом освещении.П р и м е р 1. Ацетатцеллюлознуюпленку для электрофореза Владимирского завода синтетических смол замачивают на 20-30 мин в буфере, состоящем из 1,34 г веронала, 10,3 гмединала и 5,06 г триса. Для приготовления буфера ингредиенты растворяют в дистиллированной воде принагревании до +50 С в водяной банеи после охлаждения до +20 С доводятдо объема 1 л, рН раствора 8,8, ионная сила 0,.075, Буфер используют вкачестве электродного. После 25 минвыдержки, когда .пленки достаточнонамокнут, на них наносят растворисследуемого гомогената сердечноймышцы, Нанесение проводят пастеровской пипеткой с сильно оттянутымносиком. Количество наносимого гомогената около 10 мкл. Затем ломещают в электрофоретическую камеру,располагая ее таким образом, чтобысторояа, яа которую нанесены образцы, была обращена вниз. Электрофореэпроводят при напряжении 350 В и силе тока 10 мА в течение 10 мин. Доначала электрофореэа на другую аналогично. вымоченную в буфере пленкунаносят инкубирующую смесь, котораясостоит из растворов 1, 2, 3 и 4в соотношении :1:0,1:1 соответственно,Раствор 1 (моль)Гликоген 292,4 10 3Аденозин-монофосфат йаГлюкоэо,6-дифосфат 0,066 10 3Этилендиаминаминотетрауксусная кислота (ЭДТА)32,7 10 э 30 30 35 40 образовавшемуся в. результате биохимической реакции из гликогенфосфорилаэы в прецлагаемом проявляется в ф 5,ультрафиолете образовавшийся никотинамиддниуклеотид (,НАДН)Используемые в способе состав инкубирующей смеси и условия электроФореэа дают возможность выявлять каж= 50 дый из изоферментов отдельно с хорошей воспроизводимостью. Требуемыереактивы и.ацетатцеллюлозная пленкапроизводятся и выпускаются отечественной промышленностью.55 Метод изоферментного разделениягликогенфосфорилаэы исрользуют дляопределения иэоэимной активностигликогенфосфорилазы в сывороткекрови при инфаркте миокарда или при 60 ранней его диагностике. Способ мето,дически прост и может быть легко внедренв клиническую: практику,а также в практику биохимических исследований,1710 3 30 10 Тираж 871 ПодписноеУжгофод;ул.Проектйая,4 Никотинамиддинуклеотид фосфат (НАДФ)И 2 6,55 10 ЗРаствор 2 (моль)Сульфат магнезииРаствор 3 (мкл)Фосфоглюкомутаэа Са,тщательного перемешивания инкубационный раствор наносят на 8 мин навымоченную ацетатцеллюлоэную пленку. По окончании электрофореэа пленки извлекают из камеры и накладывают на пленку с инкубационным раствором. Пленки прижима"ют грузом (200 г ) и помещают в термостатпри 37 С на 20 мин, Затемпленки разъединяют и просушивают при37 С в течение 10 мин. Результатыэлектрофореза исследуют при ультра"фиолетовом освещении,На электрофореграмме сердечной "мышцы отчетливо видны три изофермеита гликогенфосфорилаэы (1,1,111)которые можно количественно тестировать при помощи флюоресцентного денси. тометра. Общее время, необходимое на4.примере 1, за исключением того, чтосостав инкубирующей смеси следующий (моль):.Раствор 1 (моль).,Гликоген 291 1 10 зАденоэин-монофосфат МаГлюкоэо,б-дифосфат . 0,063 10Этилендиаминотетрауксуснаякислота (ЭДТА)Никотинамиддинуклеотид фосфат Ма (НАДФ) 6,310Раствор 2 (моль)Сульфат магнезии 31,0 10 эРаствор 3 (мкл)Фосфоглюкомутаза Са(активность 200 ф Е/мг2 мг (мл) 38 Е) 85Довести до 400 мкл 3,2 М (МН 50Глюкоз о- б- фосфатдегидрогеназа Са акВНИИПИ . Заказ 2330/55филиал ППП "Патент", г. тивность 350 Е/мг5 мг (мл) 78 Е . 45Раствор 4 - фосфатный буфер (моль)КН Р 04 327,0Ма НР 04 327,0.рн 6,8Растворы смешивают в следующихсоотношениях.0,3, 0,3, 0,003 и 0,3 млсоответственно,После проведения электрофореэа,как описано в примере 1, и окрашивания смесью приведенных растворов,исследуют пленку при ультрафиолетофвом освещении. Наблюдаем наличие темного Фона иотсутствие светлых полос ( фракций гликогенфосфорилаэы )Как видно из результатов примера 2, изменение концентрации веществ в составе инкубирующей смеси приводит к невоспроизводимости способа.Использование концентраций веществ выше, чем в примере 1, нецелесообразно, так как качество результатов то же, но удорожается процедура из".за высокой стоимости реактивов.Предлагаемый способ по сравнениюсизвестным способом сепарирования гликогенфосфорилазы в геле полиакриламида обладает рядом преимуществ.Количество реактивов, необходимое для выявления иэоферментов гликогенфосфорилаэы на ацетатцеллюлознойпленке для одного образца, в 10 раэ меньше чем при работе на геле, время исследования сокращается от суток до.одного часа. Кроме того, на ацетатцеллюлозной пленке можно анализировать одновременно несколько образцов, что позволяет сравнивать их по подвижности в электрическом поле,В отличие от известного способа, где иэоэимы идентифицируются по окра" щенному раствором Люголя гликогену,