Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов

СОЮЗ СОВЕТСНИХсаицюнщекРЕСПУБЛИН 156418 А ПИС ИЗОБРЕ ИДЕ П:ЛЬСТВУ ВТОРСНОМ чение 40-50 ми цией пленки растворе ин ибитора 0офлавина в кон 0 фМ или 1 10 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГННТ ССО(7) Научно-производственное объедин ние "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П; Стучки (72) Д,Ю, Балцере, Б.А. Гринберг, А.А. Прикулис, Е.Б. Никольская, О.,В, Ягодина и Г,К. Микелсоне :(53) 577,15 (088.8)(56) Авторское свидетельство СССР Р 1495378, кл. С 2 И 11/12, 27,07,8Пцгапй Р. ег а 1. Ап епяуше е 1 ессгойе Гог асегу 1 ейо 11 пе. - В 1 орЬуз., В 1 осйпп Асса 1978, 527, р, 277-281 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ ПЛЕНОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНО- АМИНОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фер Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фер ментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа.Целью изобретения является улучшение качества ферментсодержащих пле нок за счет повьппения избирательности анализа моноаминов и увеличения срока годности пленок.Способ заключается во введении препарата моноаминоксидазы в буфер-. ный раствор желатина, нанесении полу ченного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для полу чения пленки и ее обработки глутаровым альдегидом с последующей инку(51) 5 С 12 Б 11/1 О, 9 ментсодержащих препаратов .для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения -улучшение качества ферментсодержащихпленок за счет повьппения избирательности анализа моноаминов и увеличениесрока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок,содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение40-50 мин раствором ингибитора-профлавина в кон)1 ентрации 5 10 4 - 8 х10 фМ или 1 10 - 1,5 10М. Пленкимогут быть использованы для совместного и раздельного определения разнь)х моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10 и М, 1 табл. центрации 5 1 8.1,5 10 М.При обработке профлавином в концентрации 5 10 8 10 М ингибируется активность моноаминоксидазы,В, катализирующую дезаминирование бензиламина, Такая пленка пригодна для избирательного определения тирамина и серотонина, При концентрации проф- лавина 1 101,5 -10 з М ингибирует - ся моноаминоксидаза, дезаминирующая тирамин, Полученный препарат пригоден для определения серотонина.совместное или раздельное использование ферментсодержащих пленок позволяетболее избирательно определять моно 9 мины в биологических жидкостях. Срокгодности пленок возрастает в 3 раза,П р и м е р 1. 0,5 т желатинапомещают в стаканчик с 10 мл дистилли 5рованной воды для набухания. Затемтуда же добавляют 1 0 мл О, 05 М Фосфатного буфера, рН 7,4 и нагреваютПри перемешивании до полного растворения желатина. Далее раствор охлажодают до +25 С и вносят в него 2 г гомогената митохондрий печени свиньиили 0,01 г лиофилизированной моноаминоксидазы в 1 мл 0,05 М фосфатномбуфере, рН 7,4, перемешиваютСмесьпорциями по 5 мл выливают на ровнуюповерхность полиэтиленовой пластинкии высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина свключенной в ней моноаминоксидазойобрабатывают 10 мл 47.-ного раствораглутарового альдегида (ГА) в течение3-5 мин, После этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно 25промывают водой и 0,05 М фосфатньжбуфером, рН 7,4 и снова высушиваютв потоке воздуха в течение 1 ч (образец 1) . Далее одну сухую пленку обрабатывают 10 мл 7,6 10" моль/л раствором профлавина в течение 45 мин,После обработки профлавином пленкувысушивают в .потоке воздуха при+15 С (образец 2),Третью пленку, высушенную послеобработки глутаровым альдегидом, обрабатывают 10 мл 1,3 10 моль/л раствором профлавина в течение 45 мин.После обработки профлавином пленкуовысушивают в потоке воздуха при 15 С 40(образец 3)Ферментсодержащие пленки хранят вхолодильнике при 4-10 С.Результаты опытов приведены в таб.лице, Все пленки получают аналогично,примеру 1 за исключением концентрацииингибитора и продолжительности обработки, которые указаны в таблице.Проверка полученных Ферментсодержащих пленок проведена согласно приведенной методике.Определение моноаминов в биологической жидкости.Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью ( образец 1)55помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же 3,5 мл 0,15 моль/л раствораКС 1 или 11 аС 1 и 0,5 мл. исследуемой крови человека. , Измерительньй сосудзакрывают, помещают в термостат прио35 С, включают магнитную мешалку и10 мин пропускают 0 без СО Далеепоток 0перекрывают и герметическизакрытый сосуд выдерживают 30 мип при35 С с интенсивным перемешиванием.После инкубации ферментсодержащуюпленку вынимают, в сосуд добавляют1,4 г КС 1, охлаждают сосуд до 25 С,закрывают пробкой с рН стекляннымэлектродом, на поверхность которогопомещена капля 0,27-ного растворатритона Х(ПАВ) в бидистиллированной воде, снова пропускают 0безСОп и затем через капилляр вводят вреакционную смесь 0,2 мл 1 моль/лБаОН (рН раствора12) для полногоосвобождения БН, После установленияпостоянного потенциала (рН)(20 мин)на электроде записывают показанияпотенциометра (рН-метра). Находятпо градуировочной прямой значениеконцентрации общих моноаминов (МА),соответствующее значению потенциала.Для контроля содержания аммонияв крови (Фоновое содержание 1 Н )проводят описанный опыт только в реакционной смеси, вместо ферментсодержащей пленки с МАО активностью помещают контрольную желатиновую пленку без фермента.Общее содержание моноаминов в кро.:ви рассчитывают как разность междуобщим количеством аммиака минус фоновое количество аммиака, Оно составляет 0,33 мкг/мл кровиСодержание тирамина и серотонинав модельной смеси,Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью, обработаннуюпрофлавином с концентрацией 6 "10 моль/л (образец 2) помещают в сосуд для измерений электрода с газовымзазором, добавляют 0,32 мл 5 10 моль/лраствора серотонина, 0,24 мл 5-ь10 моль/л раствора тирамина и0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина . Туда же добавляют 3, 2 мл Кфосфатного буфера, рН 7,6, Таким образом, концентрация в реакционной смеси: серотонина 4 10 моль/л, тирамина - 3 10 моль/л, бензинамина -3 10 моль/л.Общая концентрация моноаминов вреакционной смеси 1 10 моль/л,Измерительный сосуд закрывают., помещают в термостат при 45 С, включа4187 6 45 После установления постоянного потенциала (рН) на электроде записывают показания рН-метра. 50 рамина и серотонина 0,26 мкг/мл крови, соответствующее значению потенжелатиковую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концент рацией 8 1 О" моль/л в течение 50 мин. 5 156ют магнитную мешалку и 1 О мин пропускают О беэ СО. Далее поток Оперекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 45 С иинтенсивном перемешивании. Далеепроводят все операции аналогично примеру 1.Находят по градуировочной прямойзначение концентрации суммы серотонина и тирамина, т.е. 7 -10 7 моль/л, соответствующее значению потенциала.Определение серотонина в модельной смеси.Ферментсодержащий-препарат - пленку с МАО активностью, обработаннуюфосфатным буферным раствором профлавина с концентрацией ингибитора 1,3"10 моль/л в течение 45 мин (обра эец 8), помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 0,32 мл 510 моль/л раствора серотонина,0,24 мл 5 10 моль/л раствора тирамина и 0,24 мл 5 1 0- моль/л растворабензиламина. Туда же добавляют 3,2 млК-Фосфатного буфера, рН 7,6. Концентрация в реакционной среде, моль/л:-7 7серотоник 4 10;тирамин 3 10; бензиламин 3 10Общая концентрация моноаминов вреакционной смеси 1 10 моль/л.Измерительный сосуд закрывают, поомещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 1 О мин пропускают О 7 без СО.Затем поток Оперекрывают и герметически закрытый сосуд вьдерживаоют 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят аналогично примеру 1,Находят по градуировочной прямойзначение концентрации серотонина 310 моль/л, соответствующее значениюпотенциала.П р и м е р 2, Определение суммарного количества тирамина и серотонина.0,5 г келатина помещают в стаканчике с 10 мп дистиллированной водыдля набухания. Затем туда же добавляют 1 О мл 0,05 М фосфатного буфера,рН 7,4, и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина.Далее раствор охлаждают до +25 Си вносят в него 2 г гомогената.митохондрий печени свиньи в 1 мл 0,05 Мфосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают. Смесь выливают на ровную пос 10 15 20 25 30 35 40 верхность и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в кей МАО обрабатывают 10 мл 4 Х-ного раствора глу тарового альдегида в течение 5 мин,После этого избыток раствора альдегида сливают, а пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфат" ным буфером, рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч.Сухую желатиковую пленку с МАО активностью обрабатывают 10 мп раствора профлавина с концентрацией 5 1 О моль/л в течение 40 мик. После обработки избыток раствора сливают, пленку промывают фосфатным буфером и высушивают в потоке воздуха.Пленка пригодна для определения суммарного количества тирамина и серотонина в биологических жидкостях,Пленку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раство ра КС 1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40 С, включают магнитную мешалку и 1 О мин пропускают О 7 без СО 7, Далее поток перекрывают и герметически закрытый соо суд выдерживают 50 мин,при 40 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС 1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой с рН стеклякным электродом, ка поверхность которого помещена капля 0,2 Е-ного раствора тритона Хв бидистиллированной воде, снова пропускают О без СО и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л ИаОН (рН 3 12),для полного освобождения аммиака. По градуировочной прямой находятзначение суммарной концентрации тициала, П р и м е р 3. Определение содержания тирамина и серотонина в крови ведут аналогично примеру 2, однакоприменяют ферментсодержащий препарат. 564187По градуировочной прямой находят суммарную концентрацию тирамина и серотонина 0,27 мкг/мл крови.П р и м е р 4. Получают желатиновую пленку с МАО активноотью согласно примеру 2. Сухую пленку обрабатывают 10 мп фосфатного буферного раствора профлавина с концентрацией 41 О моль/л в течение 35 мин. 1 О После обработки высушенную пленку проверяют для определения тирамина и серотонина в крови.Инкубирование и определение аналогично примеру 2, Объем исследуемой крови также 0,5 мп, По градуировочной прямой находят значение концентрации моноаминов 0,30 мкг/мл, соответствующее значению потенциала. В данном случае результат завышен из-за недостаточного ингибирования активных центров МАО, ответственных за дезаминирование бензиламина и, следовательно, .определяется еще и25 часть бензиламина. П р и м е р 6. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3 1 О-моль/л в течение 40 мин, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым, зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 мл/л раствора КС 1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.Далее проводят все операции аналогично примеру 2. 50 П р и м е р 5. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, 30 обработанную профлавином с концентрацией 9,5 10 "моль/л. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и 05 исследуемой крови, Инкубирование и оп- ределение аналогично примеру 2.По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов 0,24 мкг/мл . В данном случае результат занижен, поскольку завышенная концентрация ингибитора час тично ингибировала уже активные центры МАО, ответственные за дезаминирЬвание тирамина и, следовательно, определяется все количество серотонина и только часть тиранина, Препа рат не пригоден для суммарного опре-, деления тирамина и серотонина. Находят по градуировочной прямойзначение концентрации серотонина. 0,15 мкг/мл,П р и м е р 7. Определение ведутаналогично примеру 2 с использовани"ем желатиновой пленки, обработаннойпрофлавином с концентрацией ,5 х"10моль/л.Находят концентрацию серотонина0,15 мкг/мл.П р и м е р 8. Определение ведутаналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработаннойпрофлавином с концентрацией 1,4 х10 моль/л в течение 50 мин.Найденная концентрация серотонина 1,15 мкг/мл.П р и м е р 9, Ферментсодержащийпрепарат - пленку с МАО активностью,обработанную профлавином с концентрацией 9,0 10 " моль/л в течение60 мин, помещают в сосуд. Добавлявт 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1и 0,5 мл исследуемой крови. Далееинкубирование и определение аналогично примеру 2,По градуировочной кривой находятзначение концентрации моноамина0,17 мкг/мл. В данном случае результат концентрации серотонина завышен, поскольку концентрация ингибитора профлавина была недостаточнойдля полного ингибирования активныхцентров МАО, дезаминирующих тирамин,и, следовательно, вместе с серотонином определяется еще часть тиранина,П р и м е р 10. Ферментсодержащийпрепарат - пленку с МАО активностью,обработанную профлавином с концентрацией 1,6 О- моль/л в течение45 мин, помещают в сосуд, Добавляют3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и0,5 исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2. По градуировочной кривой нахоцят значение концентрации моноамина ; 0,15 мкг/мл. Так же как в примерах 6- 8 определяется все количество серо- тонина. Следовательно, оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная препаратом профлавином с концентрацией 110 з,5 10-моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообразным.15 Ь "1.1 Найденные в зналиэируемой смеси ма- ноамины Образец Введенные в анализируемую смесь моноамины, моль/л Продолжит ельОбработка профлавином с концентрацией, моль/л ностьобработки,мин Тира- Серота- Бензил- Суммарн,мин нин амин колич,моль/л Состав Без обработки профлавином 3104"О1 10 (Суммарноесколичество 3, О-о тирамана,сератонинаи бензиламина7,00 "10 7 Суммарноеколичество 3 10 3 104 10 1 10 с 610-4 тирамина и серотонина 695 10 Суммарное количество1 10 3 О 4107 310 50 8 10-4 3 1 О4103104,10-7 тирамюа исератонина6,97 10-"85 1 О 7 Суммарноеколичество 31 О 5 1 О-Ф 4 10-Ф 40 35 тираминаи серотоеееена, частьбенэиламина 5,8 10Общее количество серо 3 104 103 1 О10 с ф 6 9 1 ОФ 60 танина и 9 156418Желатиновые пленки обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку проф- лавин является необратимым ингибитором МАО и в условиях использования пленок профлавин не вымывается в течение всего срока пригодности, кото-. рый лимитируется механической сохранностью пленки. Срок годности плен О ки 4 мес (при проведении 5 определений ежедневно), В сухом виде прио4-10 С - ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес. Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментсодержащие пленки, пригодные для определения моноаминов, с улучшенными характеристиками, а именно с увеличен=. 20 ными избирательностью и сроками годности, В 3 раза увеличивается срок годности и возникает возмо;кность совместного и раздельного определения моноаминов в биологических жидкостях 25 без введенияв системудля определения 7 1 Одополнительных комичес"."-я 1.ибтсрог моноаминоксидаз, Лрепар.т обеспечивает предел обнаружепя моноаминов до 10 М. формула изобретения Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов, включающий введение препарата моноаминоксидазы в буферный раствор желатина, нанесение полученного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и последующую обработку поверхности пленки глутаровым альдегидом, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью улучшения качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок, полученную пленку обрабатывают в течение 40-50 мин раствором ингибиторапрофлавина в концентрации 5 10 48 1 О 4 М или 1 О1,5 1 ОМ.12ПродОлжение таблицы 1564187 Введенные в анализируемую смесь моноамины моль/л Образец Найденные в анализируемой смеси мо- ноамины родол- жительностьобрабоки,Бензиламин Серот -Сумм арн; колич .и моль ст 10 4,.10 310 410" 3 1 О410 3 1 О 4 О1,310 4 1,510 1 5 1,7106 1 0-7 1 О-" 11 О11 О10Составитель В. Муромактор Т. Лазоренко Техред Л,Олийнык Корректор М. Самборск 1139 Тираж 484Государственного комитета по113035, Москва, Ж - 3 Подписноеизобретениям и открытиям при ГКНТ СССРРаушская наб., д. 4/5 ИИП изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 бработка профлавиом с конентранией оль/л часть тирамнна3,98 10 Только серотонин 3,99 10 1 -в,0 103,99101,